任务1.2　天然药物化学成分的分离

天然药物化学成分可以根据物质的溶解度差别、在两相溶剂中的配比不同、吸附性能差别、分子大小差别、离解程度不同等因素进行分离。

1.2.1　系统溶剂法

1.2.1.1　原理

系统溶剂法是根据不同化学成分的极性差异，选用几种不同极性的溶剂组成溶剂系统，由低极性到高极性逐步对浓缩后的总提取物进行提取分离。常用的溶剂见表1.2。

1.2.1.2　适用范围

系统溶剂法是早年研究天然药物化学有效成分的一种最主要的方法，主要用于分离提纯含有不同极性的各种化学成分的提取，目前仍用于不明化学成分的分离。但此法在微量成分、结构性质相似成分的分离纯化上有很大局限性。

1.2.2　两相溶剂萃取法

两相溶剂萃取法又称“萃取法”。在提取液中加入一种与其不混溶的溶剂，充分振摇以增加相互接触的机会，使原提取液中的某种成分逐渐转溶到加入的溶剂中，而其他成分仍留在原提取液中，从而实现分离。

1.2.2.1　原理

在一定的温度和压力下，某物质在两种互不相溶的溶剂中溶解，达到动态平衡时，该物质在两种溶剂相中的浓度之比为一常数，称为分配系数（K）。可用下式表示：

K=cU/cL

式中，K为分配系数；cU为溶质在上相溶剂中的浓度；cL为溶质在下相溶剂中的浓度。

混合物中各种成分在同一两相溶剂系统中分别有各自不同的分配系数。萃取时混合物中各种成分在两相溶剂中分配系数差异越大，则分离效果越好。分离的难易可用分离因子（β）来表示。分离因子为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。可用下式表示：

β=KA/KB（KA>KB）

β≥100，一次萃取就可实现基本分离；100>β≥10，需萃取10～12次；β≤2，需萃取100次以上；β≈1，无法实现分离。

因此在实际工作中，应选择β值大的溶剂系统，以简化分离过程，提高分离效果。也可根据β大小选择合适的分离方法。

1.2.2.2　萃取方法

（1）简单萃取法

实验室用分液漏斗或下口瓶，一般选择容积较被萃取液大1～2倍的分液漏斗。工业上可用大型密闭的萃取缸。适用于分配系数差异较大的成分的分离。萃取中常产生乳化现象，可通过静置、加热、盐析、改变表面张力等方式解决。

（2）pH梯度萃取法

pH梯度萃取法的操作同简单萃取法。将待分离成分溶于与水不相溶的有机溶剂，依次选用pH值由低到高的碱水溶液作萃取剂进行萃取，可使不同成分按照酸性由强至弱的顺序分离出来。若选用pH值由高至低的酸性缓冲溶液作萃取剂顺次萃取，可使碱性由强到弱的生物碱分别萃取出来。

（3）逆流连续萃取法

逆流连续萃取法利用两溶液密度不同自然分层，分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。此法可避免用分液漏斗多次萃取操作造成的麻烦和乳化现象的发生。其原理如图1.6所示，高槽内放密度小的有机溶剂，管子内装入水提取液，柱子内部填充瓷圈或玻璃填充物，萃取就可以连续进行。

①逆流分溶法（counter current distribution，CCD）是一种高效、多次、连续的两相溶剂萃取分离方法，亦称逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。如图1.7所示，将提取物加入到第一管中，在流动相和固定相之间达到分配平衡，然后由流动相带入第二管中完成分配平衡，反复重复操作，混合物中各成分根据在两相的分配系数的不同，以一定速率迁移到各管中，直至最后，在各管中保留在固定相中分配比由大到小的各物质。

逆流分溶法具有很强的分离混合物各组分的能力，特别适合于分离中等极性、分离因子较小及不稳定的物质，甚至对一些用色谱法不能分离的高分子化合物如多肽、蛋白质等都已进行成功分离。但此法不适于分离微量成分、试样极性过大或过小，以及分配系数受温度或浓度影响过大及易于产生乳化现象的溶剂系统。

②液滴逆流分配法（droplet counter current chromatography，DCCC）又称液滴逆流色谱法，是在逆流分溶法基础上改进的新方法。其原理与逆流分溶法相似，利用混合物中各成分在两液相间的分配系数的差异，使流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱实现逆流分配，从而达到分离目的。此法使用溶剂较少，可定量回收溶剂，不需振荡，不会产生乳化现象，分离效果好于CCD法，广泛应用于皂苷、生物碱、蛋白质、糖类等中药化学成分的分离与精制，特别是分离皂苷，效果良好。

③高速逆流色谱法（high speed counter current chromatography，HSCCC）是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动时在互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC法相媲美。HSCCC法分离效率高，产品纯度高；不存在载体对样品的吸附和污染；制备量大和溶剂消耗少；操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。该法已广泛用于皂苷、酚类、生物碱、蛋白质、糖类等中药化学成分的分离精制，效果良好。

1.2.3　结晶法

天然药物化学成分在常温下多半呈固态，都具有结晶的通性，可以根据溶解度的不同，用结晶法来达到分离精制的目的。研究天然药物化学成分时，一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定。

（1）基本原理

结晶法是利用不同温度可引起物质溶解度的改变的性质来分离混合物中的不同成分。非结晶状态的物质通过温度的改变出现结晶的操作称为结晶。不纯的结晶物进一步结晶处理得到较纯的结晶的操作称为重结晶。结晶后的液体称为母液。

（2）溶剂的选择

溶剂的沸点要适中；与结晶物不发生反应；对所需要的成分冷时溶解度较小，而热时溶解度较大；对杂质冷热均溶，或冷热均不溶；能给出很好的晶型。溶剂一般常用甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯等。除选用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。一般是将化合物溶于易溶的溶剂中，在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后，放置结晶。例如β-细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好的结晶。又如从虎杖中提取水溶性的虎杖苷时，可在已饱和的水溶液上加上一层乙醚，既可溶出脂溶性杂质，又可降低水的极性，促使虎杖苷的结晶化。自秦皮中提取七叶苷（秦皮甲素）也可运用这样的办法。

（3）结晶法操作

通常将需结晶物质置于锥形瓶中，加入少量的溶剂，于水浴上加热至微沸，逐步添加溶剂，直至所需结晶物质刚好完全溶解，趁热过滤，静置，冷却析晶。然后采用减压抽滤，把结晶从母液中分离出来。晶体需用少量溶剂洗涤，以除去表面的母液。上述得到的结晶为粗晶，仍含有杂质，需反复进行重结晶后才可得到较纯晶体。结晶后的母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶，这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。

（4）结晶纯度的判定

化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，可以作为鉴定的初步依据。结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品碱在三氯甲烷中形成棱柱状结晶，熔点207℃；在丙酮中则形成半球状结晶，熔点203℃；在三氯甲烷和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。所以在化合物的晶形、熔点之后需注明所用溶剂。一般单体纯化合物结晶的熔距较窄，要求在0.5℃左右，如果熔距较长则表示化合物不纯。

（5）注意事项

结晶过程中，溶液浓度高，降温快，析出结晶的速度快。但是其结晶的颗粒较小，杂质多。有时自溶液中析出的速度太快，超过化合物晶核的形成和分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉末。有时溶液太浓，黏度大反而不易结晶化。如果溶液浓度适当，温度慢慢降低，有可能析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，例如铃兰毒苷等，有时需放置数天或更长的时间。如果放置一段时间后没有结晶析出，可以加种晶诱导晶核形成。

1.2.4　沉淀法

1.2.4.1　基本原理

沉淀法是在药物提取液中加入某些试剂，生成沉淀或降低其溶解性而从溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。采用沉淀法分离化合物，若生成沉淀的是有效成分，则要求沉淀反应必须可逆，以便化合物再生。

1.2.4.2　沉淀法操作

（1）酸碱沉淀法

利用某些成分在酸或碱中溶解，继而又在碱或酸中生成沉淀的性质达到分离的方法。这种方法是可逆的，可使有效成分与杂质分离。常用的有酸提取碱沉法、碱提取酸沉法、等电点沉淀法等。

（2）改变极性，降低溶解度沉淀法

改变溶剂的极性，让某些成分沉淀。例如在水提浓缩液中加入乙醇达60%，可使多糖、蛋白质、树胶等逐步沉淀出来。于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分，如油脂、叶绿素、色素等。在药材浓缩的乙醇提取液中加入数倍量乙醚（醇提醚沉法）或丙酮（醇提丙酮沉淀法），可使皂苷沉淀析出。

（3）专属试剂沉淀法

例如在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出。此外，还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质，胆甾醇也常用于沉淀洋地黄皂苷等。

（4）铅盐沉淀法

乙酸铅及碱式乙酸铅在水及醇溶液中，能与多种天然药物化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。常用中性乙酸铅和碱式乙酸铅。中性乙酸铅可沉淀酸性物质或某些酚性物质，碱式乙酸铅沉淀范围更广。

铅盐沉淀可悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，转为不溶性硫化铅而沉淀。溶液中可能存有多余的硫化氢，须通入空气或二氧化碳带出多余的硫化氢气体。也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等除铅，但生成的铅盐在水中仍有一定的溶解度，除铅不彻底。用阳离子交换树脂脱铅快而彻底，但要注意药液中某些有效成分也可能被交换上去，同时脱铅树脂再生也较困难。

（5）絮凝沉淀法

在提取浓缩液中加入一种絮凝沉淀剂，以吸附架桥或电中和方式与蛋白质果胶等发生分子间作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子，以达到精制和提高成品质量目的。絮凝剂的种类很多，有鞣酸、明胶、蛋清、101果汁澄清剂、ZTC澄清剂、壳聚糖等。

（6）盐析法

盐析法是在药物的水提液中加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如在三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷即可沉淀析出；自黄藤中提取掌叶防己碱、自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵进行盐析。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，可先在水提取液中加入一定量的氯化钠，再用有机溶剂萃取。

1.2.5　膜分离法

膜分离法是利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合液的化学成分进行分离、分级、提纯。提取液中小分子物质或能在水、乙醇提取液中解离成离子的物质可通过透析膜，而大分子物质（如多糖、蛋白质、鞣质、树脂等）不能通过透析膜，从而达到分离。目前膜分离法主要有反渗透、超滤、微滤、电渗析四种。

1.2.6　升华法

固态物质不经过液态过程，直接蒸发变成蒸气的过程叫作“升华”。某些天然药物化学成分具有升华性，如某些小分子生物碱、香豆素等均可用升华法进行纯化。但在升华过程中，往往伴随热分解情况，产率较低，不适宜大规模生产。

1.2.7　分馏法

分馏法是采用多次蒸馏的方法对沸点相近的混合物进行分离和提纯的方法。两种液态物质沸点相差100℃以上时，可用反复蒸馏法将其分开；沸点相差25℃以下时，用蒸馏的方法则难以达到分离目的，需用分馏柱；沸点相差越小，则需要的分馏装置越精细。

（1）原理

分馏的原理跟蒸馏基本相同，也是加热使混合液体汽化冷凝的连续操作过程。比常规蒸馏装置中增加一个分馏柱（工业上称为分馏塔盘），被加热的混合蒸气进入分馏柱，与内壁上已冷凝（空气冷却）回流液体发生对流而交换热量，使其中沸点较高的成分放热被液化，回流液体中沸点较低的成分吸热又汽化。在这种反复液化与汽化过程，沸点较低的蒸气成分上升进入冷凝器（水冷却）液化而分离出来。

（2）分馏装置

分馏装置见图1.8，其中分馏柱的作用是增加上升蒸气在到达冷凝管以前与回流冷凝液的接触面积，以进行充分的热交换，在分馏柱内可装入特制的填料以提高分馏效率。实验室常用的分馏装置见图1.8（a），有刺形分馏柱和填料分馏住。工业上应用的分馏装置见图1.8（b），应用的分馏柱塔有板式和填料式两种。