第三节 纳豆激酶的生产调控和分子改造
为了使纳豆激酶能够工业化生产并可以药用，提高纳豆激酶的产量就变得非常关键，同时有目的地对纳豆激酶进行分子改造，改善纳豆激酶的生物学特性，可延长酶的半衰期、提高酶活力和增加热稳定性。常用的途径有三种：①对野生菌种进行筛选、诱变，以获得高产酶量的纳豆菌株；②优化发酵培养基及发酵条件；③运用基因工程技术改造纳豆激酶的基因，获得高产、高活性酶，具有目前正在使用的一些溶栓剂所无法比拟的优点。人们渴望能将纳豆杆菌开发为新一代的工程菌。
一、目前已经选育的纳豆杆菌
由于使用不同的纳豆菌发酵产生的纳豆激酶的量和活性有很大差别，因而，如何获得合适的菌株，并控制一定的条件，使纳豆激酶占纤溶成分中的大部分甚至全部，对大规模生产是至关重要的。首先是菌种选育，有意识地分离筛选纳豆激酶活力高的菌株，并进一步诱变，提高酶的活力以及酶的热稳定性。
自1987年起，人们在一些海洋生物、日本飞鱼shiokara、韩国酱油、大酱、中国台湾地区的土壤、中国豆豉、酱油大曲、豆粕、药酒、亚洲发酵虾酱中分离到相似的纤溶蛋白酶生产菌。
满丽莉等从大豆发酵样品中筛选到菌株T-3，酶活达到3158.97FU/mL。[34]
马明等经过优化筛选，获得纳豆激酶高产菌株，酶活性达到122.73FU/mL。[35]
杨郁等从纳豆中分离筛选出N-15菌株，在培养基由2%蔗糖和2%豆粕组成，发酵温度为37℃，起始pH为7.0。用此优化培养基发酵所得到的纳豆激酶活性达到1033FU/mL。[16]
秦国宏等利用纳豆激酶生产菌B.subtilis Natto NLSSe进行κ-和γ-聚谷氨酸的联产研究，培养基中不添加谷氨酸，最后的实验结果表明，纳豆激酶酶活为121.2FU/mL，γ-聚谷氨酸产量为1.1g/L，均达到单独合成时的水平。[16]
李建强等对从腐烂叶片表面分离得到的具有溶栓活性的芽孢杆菌LJQ-纳豆激酶进行了鉴定，结果表明LJQ-纳豆激酶可能为一株枯草芽孢杆菌且溶血栓能力来自于产生的纳豆激酶。[36]
赵仲麟等从多家超市购买多种类的发酵豆制品筛选纳豆激酶产生菌。其中5号菌株溶栓圈面积为197.86 mm2，比对照活性提高83.87%，其相对于尿激酶的活性为509.64FU/mL，命名为BS纳豆激酶-5。BS纳豆激酶-5菌株同其他属菌株相比，不仅对温度有极高的耐受性，发酵生产纳豆的时间较短，所得到的纳豆产品色泽金黄，具有酱香味而没有氨臭味。同时考察了BS纳豆激酶-5菌株表达的纳豆激酶的活性和热稳定性。研究表明，BS纳豆激酶-5表达的纳豆激酶具有较高的纤溶活性和较强的热稳定性。[15，43]
一个基因的自然突变频率仅10-6～10-10，因此，以微生物的自然变异为基础得到的生产菌种的概率并不很高。为了加大菌种突变频率，可采用物理和化学手段促进诱发突变。这种以诱发突变为基础的育种就是诱变育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
通过菌种选育提高纳豆激酶的活力以及酶的热稳定性是目前研究的主要方向。在最近15年的实验中发现，紫外线、盐酸羟胺等条件对纳豆杆菌菌株有明显影响，正变率合理且能稳定遗传。
刘新梅等以纳豆菌B.N.K为出发菌株，制备原生质体，并结合紫外线诱变筛选纳豆激酶高产菌株。得到5株高产菌株DU104、DU115、DU120、DU212、DU223，酶活分别为383.65、400.74、327.15、347.16、378.98FU/mL，比出发菌株B.N.K分别提高了67.1%、74.5%、42.5%、51.2%和65.0%。[13]
方祥等以Bs01-1菌株作为出发菌种，采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种，得到两个突变菌株MBS04-6和MBS04-9，其纳豆激酶活性分别达到4179FU/mL和3788FU/mL，比出发菌株提高了87%和69%，并有良好的遗传性能。[38]
余功保等[12]采用紫外线诱变处理，筛选得到BSM-3菌株。原始菌株酶活为248FU/mL。BSN-3菌株的酶活为640 U/mL。得到的BSN-3菌株的酶活比原始菌株的酶活提高了258%。[12]
关志炜等对菌株NT-6分别进行盐酸羟胺单独诱变、紫外线单独诱变和盐酸羟胺与紫外线复合诱变，得到产酶能力强于NT-6的菌株53株，正突变率达到17.7%，产酶量均在400FU/mL以上（NT-6在相同发酵条件下产生的纳豆激酶活力为386.14FU/mL）。其中编号为NT207的突变株（通过紫外线和盐酸羟胺复合诱变方法获得）的发酵液酶活达到648.72FU/mL，较诱变前提高了68%。[11]
夏丽等通过紫外线直接照射平板，即诱变条件为20 W紫外灯，距离30cm，照射240 s，筛选得到一个高产突变株U-5，其纳豆激酶纤溶活力达到5440.37FU/mL，比出发菌株T-3提高8.81%，且U-5突变株的遗传性能稳定。[39]
王雅君等以纳豆杆菌Z1作为初始菌种做紫外诱变处理。筛选两次得到正突变纳豆杆菌菌株U49，其纳豆激酶酶活为1329.62FU/mL，比出发菌株Z 1提高了100.34%。且突变菌株U49在5次传代之后纳豆激酶酶活力仍然基本稳定，具有良好的遗传稳定性。[40]
李淑英等，采用60 Co-γ射线对BS纳豆激酶-5进行诱变选育，在最适诱变剂量800gy下，获得60株纳豆激酶活性提高的菌株，11株热稳定性提高（65℃）的菌株，正突变率高达45%，优于紫外诱变、化学诱变和二者的复合诱变育种方法。[43]
二、纳豆激酶基因工程菌——纳豆激酶基因在不同物种中的表达
天然的纳豆激酶的纤溶酶活性往往较低，通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术，构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。
Nadamura等于1992年测定了纳豆激酶基因的核苷酸序列，使得使用基因工程技术提高纳豆激酶的产量成为可能。已有学者成功地从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组中扩增得到了纳豆激酶的编码基因，构建了纳豆激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、毕赤酵母和昆虫杆状病毒中实现了表达。有研究人员还将纳豆激酶的编码基因导入番茄和生菜，制成转基因蔬菜。[29]基于目前基因工程技术的实验基础，使大规模生产稳定高效具有导向性的溶栓药物成为可能。这对于提高纳豆激酶疗效、安全性，延长药物的半衰期，降低生产成本等具有重要意义。
基因克隆的最终目的是获得有用的表达产物。当前的表达系统多以原核表达系统为主。大肠杆菌表达的酶蛋白量高，易于纯化，但是多以包涵体形式存在，需要通过变性、复性的方法才能获得有活性的酶；枯草芽孢杆菌表达的酶活性最好，但是表达量少，纯化难度大。
表2-5 纳豆激酶在大肠杆菌中的表达
巴斯德毕赤酵母作为一种真核表达系统，同时具有真核表达系统的优势及原核表达系统的快速、操作方便和廉价的特点，与哺乳动物细胞相比，更易于进行遗传操作；还可以克服大肠杆菌表达系统缺乏转录后加工修饰的缺陷；与酿酒酵母相比，其具有强启动子、分泌效率更高、表达菌株比较稳定以及表达质粒不易丢失的优点，可以生产可溶的、具有正确折叠的重组蛋白，并且可以对蛋白进行转录后加工。因此，它作为一种蛋白表达系统已得到越来越广泛的应用。
罗立新等利用线性化pPICZαA-纳豆激酶转化毕赤酵母GS 115和毕赤酵母（KM71），筛选得到重组酵母之后，通过纤维蛋白平板法与SDS-PAGE电泳法检测到重组酵母发酵上清液中有纤溶活性，首次实现了纳豆激酶基因在真核表达系统中的表达，通过凝胶薄层扫描分析表明，纳豆激酶表达量占菌体总蛋白的10%左右。虽然纳豆激酶基因在毕赤酵母的稳定性很高，但表达量低于原核系统，且远低于原始纳豆芽孢杆菌。[41]
对含纳豆激酶基因的重组毕赤酵母的培养进行优化，培养中的影响因素按重要顺序排列是温度、诱导时间、甲醇添加量、pH和培养时间。根据黄志立等的实验，这些因素的最佳组合为pH 6.0，30℃，培养36h，诱导时间84h，甲醇添加量1%。在此优化条件下，重组酵母发酵上清液蛋白含量为菌体总蛋白10%，但总体来说仍然较低，表达量无法满足用于生产的需要。[31]
敬俊锋等以宿主菌株X33为起点，利用重组线性化质粒pPICZαA-纳豆激酶通过电击转化法构建重组酵母。重组酵母的发酵上清液的溶栓活性约为253 U/mL。[32]
乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，具有刚性、致密的细胞壁；这给乳酸菌的基因工程操作，尤其是外源基因的电转化带来了较大的困难。不过，乳酸乳球菌表达出具有溶纤活性的纳豆激酶已有成功的报道，并有采用食品级的表达系统[33]的报道。
利用转基因植物作为生物反应器来生产基因工程药物或功能食品，是当今植物基因工程研究的热点之一。研究组将纳豆激酶基因通过根癌农杆菌转化到番茄中，得到在转录水平表达的转基因植株，有望用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶，但活性和含量仍需进一步优化。
陈寅等将高质量转移载体pVL-Natto DNA和野生型BmNPV DNA共转染家蚕Bm-5贴壁细胞，得到重组的BmNPV病毒。向5龄期蚕注射病毒，常规饲养4～5天至蚕血淋巴为乳白色，收集病蚕血液。测得纳豆激酶的酶活性为13.9 U/（mL血淋巴）。纳豆激酶基因在家蚕生物反应器中得到了正确表达，且产物具有降解蛋白质的生物活性。[35]
三、纳豆激酶的分子改造
针对纳豆激酶的特点和纳豆激酶分子的结构，可以有目的地对其进行分子改造。改变纳豆激酶的分子结构，使其半衰期延长、酶活力提高和热稳定性增加等。常用的方法是采用基因的定点突变。
基因的定点突变是改善酶活性或稳定性的常用方法。目前利用纳豆激酶已有结构信息进行的定点突变多集中在纳豆激酶的活性中心和底物结合部位附近的氨基酸上，而对于酶的活性和稳定性来说，这是远远不够的。
（1）与酶活力相关的点突变
纳豆激酶的活性中心包括催化三联体（Asp32、His64和Ser221）、氧离子洞（Asn155）和底物结合位点（Ser125、Leu126和Gly127）。有研究者针对纳豆激酶的活性中心位置，改变纳豆激酶活性中心Asp32附近的异亮氨酸（Ile31），然后将突变后的纳豆激酶基因转入E.coli中表达，获得了较高酶活力的纳豆激酶工程菌突变株，其催化效率是野生型的2～6倍。实验中研究者在Ile31位点引入了8种不同的氨基酸残基（Cys、Ser、Thr、Gly、Ala、Val、Leu、Phe）。结果发现只有Val31和Leu31突变株才表现出酶活力增加，特别是其中Leu31突变株的酶活力显著增加，而其他6种突变株的酶活力均明显下降。这表明在31位点的侧链氨基酸对纳豆激酶活力的表现是非常重要的，并且酶活力表现的水平依赖于侧链基团的结构。[36]另外还有研究团队选择了其他的活性中心附近的氨基酸定点突变，来研究纳豆激酶结构与活性的关系。通过空间结构分析推测纳豆激酶活性中心附近的4个亚基（Ser33、Asp60、Ser62和Thr220）形成的氢键对于稳定水解反应的转移状态十分重要。研究者还通过定点突变将上述4个亚基换成Ala。随后的酶动力学分析表明，4个亚基突变导致的氢键缺失，对于纳豆激酶的催化反应影响很大，但对底物结合效果的影响较小。
为了研究纳豆激酶的活性与底物特异性的关系，研究者定点突变分析了底物结合袋的S3亚区的3个亚基Gly100、Ser101、Leu126。分别用具有大的侧链基团和阳性电荷的氨基酸来替代，分析其与底物结合的特性和激酶催化活性是否发生变化。结果表明，第100位亚基的替换将大幅度降低纳豆激酶的底物结合和催化活性；而第101位的突变替换可以明显增加纳豆激酶的纤维蛋白溶解活性；Leu126的突变可能会损坏纳豆激酶结构域模式。深入研究表明，S3亚区的亚基对于保持纳豆激酶的活性很重要，但对底物的特异性影响不大。
（2）与稳定性相关的点突变
温度对蛋白质是个很敏感的因素。温度升高使分子内的振动增强，从而破坏维系空间结构的次级作用力，使蛋白变性。蛋白质热变性的难易是和分子的构造密切相关。纳豆激酶剂型加工过程，特别是软胶囊的加工工艺过程涉及高温环节，对纳豆激酶的热稳定性要求较高，而纳豆激酶在60℃处理瞬间失活，所以在纳豆激酶剂型加工过程中会失去大部分活性。[42]
有研究表明，将纳豆激酶氨基酸序列中的Gly61和Ser98变为Cys61和Cys98，产生Cys61/Cys98突变，再利用计算机分析，找到合适的双硫键位点，双硫键的引入（野生型纳豆激酶分子结构中无双硫键），提高了酶的耐热性（热稳定性提高了4.5℃）和半衰期（是野生型的2～3倍），而Cys61/Cys98突变后的纳豆激酶的催化性能未改变。[43]
还有研究团队先采用紫外线诱变的方法获得突变的高产菌株，在此基础上，利用基因序列比对的分析方法，对具体的与酶活升高及稳定性增高相关的突变位点进行深入探究。实验中以野生纳豆菌BN10为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方法获得突变菌株DU15，将野生菌株和突变菌株扩增得到的纳豆激酶成熟肽基因，构建载体（PPICZa-A），在毕赤酵母X-33中实现表达。结果表明，诱变菌株纳豆激酶与野生菌种相比，在65℃处理15min后，诱变菌株的热稳定性提高20%，酶的比活力提高16.6%。进一步基因序列分析表明，突变菌株有两处核苷酸发生了突变（A107G和C396T），A107G碱基突变导致氨基酸的替代D366G（Asp变成Gly），由此推断，第36位氨基酸残基的突变与纳豆激酶的热稳定性及酶活性的提高密切相关。[44]
利用酶进行化学修饰中有着广泛的优点。改善纳豆激酶活性的化学修饰可应用于纳豆激酶蛋白纯品，也可应用于大豆原材料的前期处理。
胃蛋白酶是一种来源广泛的蛋白水解酶；在pH 4.7～6.5时活力比较稳定，能催化Phe、Tyr、Leu、Glu、Gln等肽键的断裂，使大分子的蛋白质变成较小分子的多肽。而纳豆激酶的活性位点为Asp32、His64、Ser221，与底物结合的位点是Ser125、Leu126、Gly127。胃蛋白酶作为修饰剂对纳豆激酶进行水解切割，可使纳豆激酶上原来被封闭的底物结合部位暴露，从而使酶活性增加。研究者将分离纯化得到纳豆激酶用胃蛋白酶进行蛋白酶水解修饰，修饰后的纳豆激酶活力增大，热稳定性和耐酸性也得到了改善。实验得到了最佳胃蛋白酶修饰条件：修饰pH为6.5、修饰温度为39℃、修饰作用时间为8h，通过修饰，纳豆激酶的活性可提高6倍，其热稳定性和耐酸性也得到改善。
研究者在大豆原材料处理过程中加入蛋白酶酶解的步骤。即将大豆脱皮、蒸煮后用30～100FU/mL的木瓜蛋白酶和50～100FU/mL的菠萝蛋白酶进行多肽化处理40～120min，可使纳豆中纳豆激酶活性由传统大豆处理方法的2233.93FU/g提高到5300FU/g。究其原因可能在于大豆营养成分的利用率大大提高。[45]
此外，纳豆激酶的分泌表达受多种因素的影响。研究表明，纳豆激酶基因的分泌表达受ó37启动子的控制，因此，还可以通过提高启动子活性和改变蛋白肽结构来提高纳豆激酶产量。
参考文献