第四节 纳豆激酶生物微胶囊
生物微胶囊是将生物大分子、微生物、动植物细胞如酶、辅酶、蛋白质等包封在一层具有亲水性的半透膜内，形成珠状微胶囊，可以使细胞和生物大分子阻隔在微胶囊的膜内或膜外。而其他的小分子物质，包括氧、营养物质等可以自由通过，实现催化、培养或分离。
用于生物物质固定化的常用生物微胶囊有海藻酸钠类、壳聚糖类、聚丙烯酸酯类和琼脂类等，见表4-11。[47]
目前研究较多的生物微胶囊主要有聚赖氨酸/海藻酸微胶囊、甲基纤维素/海藻酸钙微胶囊、脱乙酰几丁质/海藻酸钠微胶囊、聚赖氨酸/脱乙酰几丁质/海藻酸钠双层膜微胶囊、脱乙酰几丁质/羧甲基纤维素微胶囊、甲基丙烯酸乙基酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物微胶囊、海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊等。其中，最常用的是聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊。但由于这一微胶囊制备过程比较复杂，过程涉及的物理、化学因素繁多，需要几步化学反应才能成囊，而制得的微胶囊性能差异很大。微胶囊的囊膜强度、对包囊的生物细胞所需营养的透过以及对目的产物的阻隔也不够理想，尚有待进一步研究和改善以满足需要。
表4-11 常用的生物微胶囊[47]
一、纳豆激酶产生菌的PDMDAAC-NaCS微胶囊
胰蛋白胨、酵母粉、琼脂均为国产；葡萄糖、木糖、NaCl、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4为国产分析纯。
用去离子水配制4.0%的硫酸纤维素钠（NaCS）溶液，用生理盐水配制5%聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDMDAAC）溶液。用注射器吸取NaCS溶液，滴入PDMDAAC溶液中；或者用胶囊发生器滴制。PDMDAAC溶液保持低速搅拌以加速反应进行。经2h左右的反应固化，即形成中空的NaCS-PDMDAAC微胶囊。将胶囊取出用去离子水和生理盐水溶液充分洗涤后，存放于生理盐水中备用。制备固定化菌体的生物微胶囊时，只需将NaCS溶液换为NaCS菌悬液（NaCS溶液和菌悬液以10：1混合）即可。
3.工艺说明
用NaCS制备的微胶囊对溶栓酶产生菌进行了试培养，结果发现：在不同的糖浓度条件下，2%的糖浓度是最适合培养菌的生长和产酶的条件。利用不同氮源下培养时注意到，氮源为2%胰蛋白胨、1%酵母膏时适于培养菌的生长。对于不同的装液量，通过考察250mL摇瓶中装20、30、40、50mL的培养基的实验证明，装液量为30mL时最适合菌体的生长。在胶囊装载量的考察中得出，胶囊装载量20mL为较佳的培养条件。最后，在连续培养中验证了该条件的优越性，最高酶活达到了2014FU/mL。[48]
二、纳豆激酶产生菌的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊
胰蛋白陈、酵母粉、琼脂均为国产；葡萄糖、木糖、NaCl、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4为国产分析纯。
用去离子水分别配制同体积5%的NaCS（CS）溶液和2.5%海藻酸钠（SA）溶液，按体积比10：1将NaCS溶液和纳豆菌悬液混合。此液再与SA液混合滴到CaCl2溶液中，反应30min，形成实心微胶囊，用生理盐水洗涤多次，洗去CaCl2。然后，将实心微胶囊转入PMCG溶液中，经PMCG与SA和CS的快速界面反应，在实心微胶囊周围形成一层很薄的膜。约10min后，PMCG与SA和CS在膜的附近全部反应，形成外面覆盖有一层膜的实心微胶囊。一方面，由于小分子物质Ca2+的竞争作用，聚阳离子PMCG很难进入微胶囊的内部；另一方面，这层膜虽然很薄，但比较紧密，不能透过大分子的PMCG。因此，在微胶囊内部空间就不存在PMCG，黏附在微胶囊外壁的PMCG则可通过反复洗涤去掉，不会对囊内的微生物产生不良影响。微胶囊用生理盐水洗涤多次，去除PMCG之后，转入到0.05 mol/L的柠檬酸三钠溶液中，去除胶囊液中的Ca2+，得到空心的微胶囊。
SA/CS-CaCl2/PMCG体系中除了PMCG对微生物具有毒性之外，其他成分对微生物没有明显的毒性。而且PMCG不能自由进出微胶囊，所以对囊内微生物的生长无影响。微囊化枯草杆菌的生长曲线与游离培养具有很强的相似性，说明微囊化的细胞的生长环境没有发生很大的变化，该体系具有较好的生物相容性。微胶囊具有截留生物大分子的能力，从而可以累积生物蛋白，起到浓缩的效果。微胶囊半连续培养可以达到普通游离培养的两倍浓缩效果，减轻了后续分离工作量。但纳豆激酶在培养过程中会有部分失活，且在连续培养过程中，可能会积累很多杂蛋白。[48]