人兽共患病的检验诊断
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第三节 李斯特菌病

李斯特菌病(listeriosis)又名转圈病,是由单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)引起的人、多种畜禽和啮齿动物共患的食源性疾病。单核细胞增多性李斯特菌人类感染主要对象是孕妇、新生儿、老年人及免疫功能低下人群。临床表现主要有脑膜脑炎、败血症、新生儿败血症性肉芽肿病、心内膜炎、骨髓炎,可造成孕妇流产、死胎等。家禽和啮齿类动物则主要表现为坏死性肝炎、心肌炎等。
一、疾病概况
【病原学】
李斯特菌属( Listeria)有七个种:单核细胞增多性李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、默氏李斯特菌。仅单核细胞增多性李斯特菌是人和动物共患的病原体。
李斯特菌为革兰阳性短杆菌,大小约0.5μm×(1.0~2.0)μm,无芽胞,一般不形成荚膜,有4根周毛和1根端毛,其周毛易脱落。幼龄培养物呈革兰阳性,陈旧培养物有时变阴性。2~42℃均可生长,最适生长温度35~37℃,可将被污染材料置4℃进行冷增菌。20~25℃培养有动力,37℃培养无动力。触酶阳性,氧化酶阴性,能发酵多种糖类产酸不产气,不利用枸橼酸盐,VP、甲基红试验和精氨酸双水解试验阳性。兼性厌氧,在营养丰富环境中可形成荚膜,在陈旧培养中的菌体可呈丝状。
根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原,分为4个血清型和多个亚型,抗原结构与毒力无关。1型以感染啮齿动物为主,4型以感染反刍动物为主,各型均可感染人类,以1a、2b、4b亚型最为多见,4b亚型致病力最强。本菌与葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌等有共同抗原,血清学诊断缺乏特异性。
对理化因素抵抗力较强,在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活,对碱(25g/L NaOH溶液中存活20分钟)和盐(200g/L NaCl溶液中长期存活)抵抗力强,60~70℃经5~20分钟可杀死,70%乙醇5分钟,2.5%苯酚、2.5%氢氧化钠、2.5%甲醛溶液20分钟可杀死此菌。
【流行病学】
本病在自然条件下多呈散发或区域流行。
1.传染源
单核细胞增多性李斯特菌在动物体和周围环境分布广泛,土壤是该菌重要的储藏源,水、土壤、人和动物粪便及动物饲料均有该菌存在。人的感染源可能是动物、植物和无机物。
2.传播途径
动物很容易食入该菌,并通过粪-口途径传播。经口感染是人类最常见的传播途径,经水源到厨房的食物链中的任何环节污染后,通过食入污染的软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶等而感染。该菌也可通过眼及破损皮肤、黏膜进入体内而造成感染。另外,呼吸道传播也是一个重要传播途径;孕妇感染后可通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿;性接触也是本病传播的可能途径,且有上升趋势。
3.易感人群
主要是孕妇及其胎儿或新生儿、老年人及免疫功能低下的成人。艾滋病患者的李斯特菌感染率是正常人的200余倍。
在自然界,许多动物对本病易感,目前已发现有37种野生和家养哺乳动物以及17种鸟类包括家禽可罹患本病。
【发病机制】
单核细胞增多性李斯特菌一般经胃肠道感染,侵入肠上皮细胞后被单核-巨噬细胞吞噬,并扩散到局部淋巴结,再到达各个内脏器官。可产生李斯特菌溶血素O,后者与细胞膜的胆固醇结合,导致巨噬细胞死亡。
目前,该病的确切发病机制尚不清楚。
【临床表现】
潜伏期为数日到数周。非妊娠患者约50%~60%表现为脑膜炎者,败血症但无局灶性病变者占25%~30%,脑实质病变约占10%,心内膜炎约占5%。
临床表现为脑膜炎者多数起病急,有高热、剧烈头痛,脑膜刺激征阳性,半数以上患者有神志改变。本病临床症状极端多变,可极似脑膜炎或传染性单核细胞增多症样临床表现,重症病例皮肤可出现紫癜。
临床表现为心内膜炎患者多发生于原有心瓣膜病变者,累及的瓣膜以主动脉瓣、二尖瓣较为常见。多亚急性起病,发热并有杂音出现或杂音改变,以及脑部或肺部的栓塞表现等。
若病菌侵入皮肤的伤口,则可引起皮肤李斯特菌病。在病菌入侵部位发生分布较为广泛的红斑、丘疹和脓疱,自觉疼痛。附近淋巴结肿大,可伴有发热不适和头痛。
妊娠期妇女感染此菌,出现不规则发热,可致胎儿死亡或早产。出生后婴儿可发生呼吸道胃肠道联合症状及咽后壁肉芽肿,皮肤上发生泛发性红斑及暗红色丘疹,尤其多见于躯干和小腿。
本病若不治疗则预后不良,有60%~70%患者死亡。但类似传染性单核细胞增多症的病例预后较好。
二、检验诊断
【病原学检查】
1.标本
全身感染及脑膜炎患者采集血液、脑脊液,局部病灶取脓性分泌物或咽拭子,新生儿取脐带残端、羊水、外耳道分泌物、粪便、尿液,其他采集外耳道分泌物、粪便、尿液等。
2.直接镜检
用生理盐水将处理后的标本制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
3.直接涂片染色镜检
镜下可见革兰阳性短杆菌,直或稍弯,两端钝圆,常呈V字形排列,偶有球状、双球状,无芽胞。陈旧培养物涂片可由革兰阳性转为革兰阴性,且两端着色深,易被误认为双球菌。
4.分离培养
临床标本如脑、肝、脾、血液等用LB血清增菌液培养24小时后,取出0.1ml加入到另一10ml LB血清增菌液中二次增菌,然后划线接种到李斯特菌鉴别培养基(MMA),30℃培养48小时。用白炽灯斜光照射平板,李斯特菌菌落为灰蓝或蓝色、小的圆形菌落。在血平板上形成狭窄的β溶血环。动物性食品以蛋白胨增菌液和蛋白胨琼脂培养为佳,环境标本以及有杂菌污染的标本,可置4℃冷增菌后再分离培养,以提高阳性检出率。
5.生化反应及鉴定特征
触酶阳性,氧化酶阴性,能发酵多种糖类如葡萄糖、麦芽糖、果糖、蕈糖、水杨苷,产酸不产气,3~10天分解乳糖产酸;不利用枸橼酸盐,40%胆汁不溶解,吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性,VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。在半固体培养基中25℃培养时运动活泼、形成倒立伞状生长区,35℃培养则动力不明显。CAMP试验阳性:在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,在它们中间垂直接种可疑李斯特菌,30℃培养24~48小时,可见靠近金黄色葡萄球菌接种点的产单核细胞李斯特菌的溶血能力增强。
产单核细胞李斯特菌与其他相似细菌鉴别特性见表2-4。
表2-4 产单核细胞李斯特菌与其他相似细菌鉴别特性
【免疫学检查】
目前尚无可用于李斯特菌临床诊断的免疫学方法。应用单克隆抗体技术建立的ELISA法主要用于食品中产单核细胞李斯特菌的检测。
【分子生物学检测】
用PCR方法扩增李斯特菌的23S rRNA的两段保守序列,并通过比较各扩增出来的限制性片段长度来检测李斯特菌,可鉴别分不同种的李斯特菌。另外,也可用脉冲场凝胶电泳进行病原学研究和分子流行病学分析。
【诊断建议】
李斯特菌病的确诊主要依赖于细菌培养。需特别注意根据不同病型和病期确定合适的检验方法和检测重点。
凡新生儿感染以及老年人、有免疫功能减退者而发热或有脑膜炎者,应考虑发生本病的可能。

(卢明芹 杜季梅)