第一节　心脏胚胎的细胞分化

一、胚胎的发育与细胞分化

人体胚胎从受精卵开始，经过胚前期、胚期和胎期的发育，止于胎儿出生。其胚胎发育的过程需经过细胞分裂、迁移、分化和凋亡的精密调控，而细胞分化是发育的核心。所谓细胞分化（cell differentiation）就是指同一来源的细胞逐渐产生出形态、结构及功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是细胞在空间上产生差异，形成具有特定形态和功能的组织，在时间上则是同一细胞与其从前的状态有所不同。通过细胞分化，使具有相同遗传组成的细胞，选择性地表达不同的基因，产生不同的结构蛋白、执行不同的功能，共同参与构成一个复杂的个体，所以细胞分化的实质是基因的差别表达（differential expression）。

胚前期发育过程中，随着胚胎组织细胞分化进程的进行，细胞分化的潜能或可塑性逐渐降低。哺乳动物在8个卵裂球阶段，细胞的发育处于“全能性”，即一个体细胞如受精卵一样，在一定条件下，经过分裂、分化有能力重新形成完整的个体，或者分化形成该个体任何种类的细胞。但是，发育为三胚层胚盘后，随着细胞空间关系的改变和微环境的变化，这些细胞在发生潜能上已经开始出现一定的局限性，只具有演变为多种细胞类型的能力，这些细胞被称为多能细胞（pluripotent cell）。例如Beltrami等在2003年报道了成人心脏内的c-kit细胞具有多潜能性并在体外具有增殖能力。这些细胞不仅能分化为心肌细胞，还可以分化为平滑肌细胞和内皮细胞。当经过器官发生，各种组织、细胞的命运被最终确定时，那些仅具有分化形成某一种类型能力的细胞被称为单能细胞（monopotential cell）。由单能细胞最终形成特化细胞类型的过程称为终末分化（terminal differentiation）。在细胞发育过程中，这种逐渐由“全能”变为“多能”，最后趋向于“单能”稳定型的分化趋势是细胞分化过程中的一个普遍规律。一般情况下，细胞分化的过程是不可逆的，然而在某些条件下，分化细胞的基因表达模式可以发生可逆性变化，回到其未分化状态，这一过程称为去分化（dedifferentiation）。

二、细胞分化的途径

细胞分化的机制极其复杂，主要取决于两个方面：一是细胞的内部特性，二是细胞的外部环境。前者与细胞的不对称分裂（asymmetric division）以及随机状态有关，尤其是不对称分裂使细胞内部得到不同的基因调控成分，表现出不同于其他细胞的核质关系和应答信号的能力。后者则表现为细胞应答不同的环境信号，启动特殊的基因表达，产生不同的细胞行为，如定向分裂、生长、迁移、黏附、凋亡等，这些行为在形态发生中具有极其重要的作用。具体分化途径有如下几种：

1.不对称分裂

一次不对称的分裂会造成两个子细胞的不同，在这样的一个过程中，一些重要的分子在分裂时被不均等地分配到两个子细胞中。这些分子通过直接或间接地改变所在子细胞基因表达的格局，决定这个细胞的命运。不对称的分裂在发育的初期、受精卵分裂成不同命运的子细胞时非常普遍，但在晚期阶段，如神经细胞发生时也会出现。在哺乳动物中，干细胞的分裂也是不对称的，可以产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞只具有有限的自我更新能力，属于多能或单能干细胞。

2.细胞间的相互诱导

所谓诱导（induction）就是指胚胎发生过程中两个细胞群体，即两种胚胎组织，通过相互作用使一个细胞群体或两个细胞群体都发生定向分化的过程。一般说来，在诱导过程中，一个细胞群体发出和传递一种细胞信息或生物刺激，另一个细胞群体则接受这种信息或刺激并发生相应的反应。前者称诱导组织（inducer tissue），后者称反应组织（responding tissue）。这种诱导是通过信号来实现的，其中有些诱导信号是短距离的，仅限于相互接触的细胞间；有些是长距离的，通过扩散作用于靶细胞。诱导方式分为如下两种：

（1）接触性诱导（contact induction）：

是通过诱导组织与反应组织间的细胞接触而实现的一种诱导。细胞间的接触有两种方式，即简单的表面接触和细胞间的缝隙连接。在简单的表面接触中，诱导细胞引起的反应细胞膜上的局部变化迅速扩展到整个细胞膜，通过细胞内信号传导系统引起基因转录和表达的变化，从而导致细胞形态结构和代谢方面的分化发育。借助缝隙连接而形成的细胞接触，沟通了诱导细胞和反应细胞间的生物信息，从而诱导了反应细胞的分化。细胞接触性诱导的存在已为若干实验和观察所证实，但其诱导信号的传导途径和反应细胞的反应机制至今仍未阐明。

（2）非接触性诱导（noncontact induction）：

是一种较接触性诱导更广泛的组织诱导方式。很多证据表明，与前侧内胚层共同培养，能诱使后侧非心脏中胚层分化成心脏谱系细胞。在培养过程中，将后侧中胚层短暂地放置到纤维母细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和骨形成蛋白（bone morphogenetic pro-tein，，BMP）中也足以诱导心脏发育。这一实验说明，对中胚层的诱导作用，可以不通过细胞的直接接触而实现。

3.细胞内在程序的调控

发育过程中，细胞在最初的特化之后，通过增殖使细胞的数量得以增加，然后通过一系列局部的诱导作用，对最初的细胞群逐步地进行细化和精加工。细胞因子在相邻的细胞中诱导一部分细胞以第三种方式特化，第三种细胞反过来再把信号传给旁边的其他两种细胞，产生第四种乃至第五种细胞，其余以此类推。这种渐进式地产生更复杂格局的策略被称为依次诱导（sequential induction）。通过这种细胞内在程序的调控方式在最初构成的大致轮廓的基础上一次又一次地精雕细琢。

4.细胞行为

外界信号和细胞的固有特征，不仅决定细胞内部的基因表达，而且还影响细胞的行为，使其参与形态的构建和进一步的分化。这些行为主要包括定向分裂（directed mitosis）、差别生长（differential growth）、细胞凋亡（apoptosis）、细胞迁移（migration）、区别黏附（differential adhesion）、细胞收缩（contraction）、基质膨胀（matrix swelling）、缝隙连接（gap junction）和细胞融合（fusion）等。例如小鼠胚胎发育的第8.5天，心肌前体细胞迁移至胚胎的前侧区，要求心肌细胞正确分化；同时为了指导迁移还需要信号途径引导细胞移向腹中线或是阻止某些侧板细胞的迁移。

5.细胞生长控制

细胞生长控制不仅是发育中形态构建的重要机制，也是成体形态维持的重要机制。细胞生长主要取决于刺激细胞分裂、抑制细胞分裂及细胞凋亡的状态，这些过程都受外界信号的调节。如肌肉细胞发育的原肠胚形成阶段，整个胚胎细胞都能合成肌球蛋白，但原肠期以后，合成肌球蛋白的细胞仅局限于心区，而其他部位的细胞则被抑制。

三、心脏细胞的起源

早在胚胎原始心管形成之初，心肌细胞和心内膜细胞两种细胞谱系就已经确定。其中前者构成了心脏的绝大部分（占95%），最终形成心房心肌细胞群、心室心肌细胞群和心脏传导系统细胞群；后者在心脏中只占很小一部分（约5%），最终分化形成心内膜、瓣膜、隔膜等组织。

1.心内膜细胞和心肌细胞的起源

在原始心管阶段，中胚层生心区细胞首先是一层上皮细胞，随后这层细胞产生两个亚细胞群：其中大部分仍然作为上皮层细胞存在，维持N型钙黏着蛋白的表达，后分化成心肌细胞；而较小的亚细胞群则减弱了N型钙黏着蛋白的表达，从初期的上皮层中迁移出来，成为内胚层心内膜的前体细胞。而心房和心室肌细胞前体在囊胚期中期分离，在中胚层细胞移入生心区时已经形成了。2004年，Messina等人从人和小鼠的心脏中分离出了心肌前体细胞，这些心肌干细胞可以在体外增殖、分化。2005年，Laugwitz等报道了ISL1（一种LIM同源异型的转录因子）可以用来标记出生后心脏中的心肌前体细胞。在出生后的心脏，ISL1阳性的细胞可以进行自我更新，并在纯系选择后迅速分化为成熟的心肌细胞。

2.心脏传导系统的起源

心脏传导系统的细胞与心肌细胞相比具有自身的特点：如半径较大、肌原纤维分布较少，糖原含量大量增加，含有神经元特异性蛋白，如神经丝蛋白、脑相关的糖蛋白。但确定的细胞谱系说明浦肯野纤维的前体细胞是心肌细胞衍生物而非神经嵴细胞衍生物。另外有研究表明浦肯野纤维的分化和冠状血管的发育在时空上关系密切，提示冠状血管形成的诱导作用可能使收缩性的肌肉细胞形成浦肯野纤维。虽然心房心室连接处的细胞在发育早期就停止增殖，但此处的环状结构仍被认为是传导系统形成的起始位点。

3.冠状血管细胞系的起源

冠状血管的前体、内皮层细胞以及来自神经嵴的血管平滑肌细胞都在胚胎发育的第3周进入心脏。冠状血管的形成有两种方式：血管发生和维管发生。前者是指从已形成的血管上长出或分支而成的新血管；后者则是由局部内皮小囊融合而形成新血管。目前对于冠状血管的形成方式还存在争议，有一种模型认为冠状血管网通过如下发生机制形成：在外心膜形成时，独立的内皮层和平滑肌前体从前外心膜移入管状心脏；内皮层细胞分化成为窦状小管囊，随后融合成为毛细血管；一旦封闭的血管网建立起来并环化成大动脉，心脏内平滑肌细胞前体就迁移至确定的内皮层通道处，参与冠状血管的形成。

四、心脏胚胎组织的分化

胚期发育过程中，侧中胚层（lateral mesoderm）位于中胚层最外侧的部分，两侧的侧中胚层在口咽膜的头侧汇合为生心区。随着胚体的形成，生心区移到胚体原始消化管的腹侧，口咽膜的尾侧，分化形成原始心管。之后胚内体腔出现，侧中胚层分裂为体壁中胚层（parietal mesoderm）及脏壁中胚层（visceralmeso-derm），前者分化为体壁的骨骼、肌肉、血管和结缔组织；后者覆盖于原始消化管外面，分化为消化和呼吸系统的肌组织、血管和结缔组织等。两层之间的腔为原始体腔，最初呈马蹄铁形，继而从头端到尾端分化为心包腔、胸膜腔和腹膜腔。

在心脏发育的过程中，不仅有线性心管，还存在其他区域的细胞群参与心脏的发育和成型，这些区域包括第二心脏发育区（second heart field，SHF），以及神经嵴细胞等。SHF是位于咽中胚层的一群心脏前体细胞，在胚胎期线性心管螺旋阶段时加入，参与心管的延长，并最终成为心脏流出道、右心室和右心房心肌的大部分；而神经嵴衍生的细胞移行到流出道，形成主动脉和肺动脉之间的分隔，并且分化为主动脉弓的血管平滑肌层；而线性心管则衍变为大部分左心室和左房。α-平滑肌肌动蛋白是心肌细胞分化的早期标志，α-横纹肌肌动蛋白为横纹肌特异性标志蛋白。有研究通过标记α-平滑肌肌动蛋白及α-横纹肌肌动蛋白发现人胚C10～C15期（表1-1）咽中胚层不断分化出心肌细胞添加至心脏的动脉端使流出道延长，此处是人胚的前生心区；而流出道远端的心肌可诱导前生心区细胞增殖分化为心肌细胞，证实了心脏流出道由来自SHF的前体细胞、神经嵴细胞和心脏中胚层细胞参与形成的。还有研究采用鼠早期胚胎，发现最初这些SHF细胞参与分化形成整个心管直至绕过背侧心系膜，但随着胚胎发育，与原始心管背侧隔离后，咽中胚层内的心脏祖细胞被隔离在心包背侧，即诱导原始心管其他极向的生长（图1-3）。虽然在心脏发育时线性心管和SHF如何融合还不得而知，但通过动物模型可知SHF发育过程中极小的干扰也可能导致很严重的心脏发育异常，如大动脉转位、右心室双出口、法洛四联症、室间隔缺损等。

五、心脏胚胎细胞分化的信号通路

尽管细胞分化的最终命运大相径庭，但对于分化，尤其是早期分化起主要调控作用的都是少数几种相同的信号途径（图1-4），它们按照极其相似的方式调控发育过程。大多数调控的最终结果是靶细胞的DNA转录发生改变，一些基因被激活，另一些基因被阻断，不同的信号分子激活不同的基因调节蛋白。除此之外，一个特定基因调节蛋白激活的效果还将取决于存在于细胞中的其他基因调节蛋白的联合作用，因此不同类型的细胞通常对同一种信号会有不同的反应。反应既取决于信号接受前细胞内存在的其他基因调节蛋白，体现了细胞对以往信号的记忆，也取决于细胞同时接受到的其他信号。

对于那些能够远距离作用的分子，限制其作用同样非常重要（表1-2）。大多数发育的信号蛋白在细胞外都存在着能够抑制其作用的拮抗剂。这些拮抗剂一般是能够和信号分子本身或其受体相结合的蛋白，从而阻止细胞和这些信号分子的相互作用。发育中大量的细胞分化实际上更多的是受到各种抑制剂的调节。

心脏胚胎细胞分化的重要信号通路有如下几种：

1.FGF信号通路

心脏的正常发育需要FGF信号通路中各因子的精确表达，其中FGF8已经被认为是影响发育条件突变的主要配体。FGF8不仅在SHF发育过程中参与心脏流出道、内膜垫及间隔的构建，还对神经嵴细胞有趋化作用；而神经嵴细胞也参与调节FGF8配体在SHF增殖和分化过程。FGF8的表达缺失可导致一系列的圆锥动脉干畸形，如大动脉转位，永存动脉干，右心室双出口，室间隔缺损或法洛四联症等。FGF信号通路通过FGF受体底物FRS2α来调节MAPK和PI3K信号途径。去除FRS2α基因的动物模型中，心内膜上皮间充质转化（EMT）和神经嵴细胞迁移到流出道均受到极大影响，导致流出道对位不良、间隔和瓣膜发育异常。

2.Wnt信号通路

Wnt家族是最早诱导心脏发育的信号通路之一，在心脏发育过程中起诱导、增殖、分化等作用。Wnt有三种信号通路途径：①经典通路；②非经典通路；③Wnt／钙通路。经典Wnt信号通路促进细胞的增殖，维护其未分化状态，而非经典Wnt信号通路促进细胞分化。

在原始心管形成后，经典Wnt通路参与心脏前体细胞的正常发育，并需要β-联蛋白（β-catenin）的存在，表达转录因子ISL1。如果在表达ISL1的心脏祖细胞中敲除β-catenin基因，将会影响第二生心区心肌细胞增殖，出现单一、未分开的流出道，房间隔形成异常等，导致孕13天的小鼠胚胎死亡。在孕早期中胚层祖细胞分化阶段，敲除胚体的β-catenin基因，其心脏环化和右心室形成受损，第二生心区中的ISL1大幅减少。由此推断，β-catenin能调节第二生心区的发育。

非经典通路中Wnt5a和Wnt11对心脏的正常发育也具有重要作用，他们能在心脏前体细胞分化阶段中减弱β-联蛋白信号通路对ISL1标记的前体细胞的影响。在Wnt5a和Wnt11基因缺失的动物模型中，SHF心脏前体细胞严重缺失，并伴随着Wnt／β-联蛋白的表达增加。

最近，抑制心脏发育的调控分子已经被确定，它们包括Wnts及上游的Wnt基因表达的调控因子。Wnt8c和它上游的调控因子ccdx-b在前心脏形成区不表达，它在后侧中胚层中表达。在正常发育中，Wnt抑制因子crescent在胚胎的前心区表达，这使得Wnts信号在心脏形成区将会处于一个比较低的水平。因此，促进心脏发育的调节途径在前板中出现，抑制心脏发育的调控途径在后侧板中出现。

3.Notch信号通路

在心脏发育过程中，Notch信号通路通过调控下游靶点，促进心室心肌的增生和分化，对心室小梁和腔室的发育尤为重要。同时，Notch信号通路也参与上皮间质转化过程，EMT对心脏瓣膜及间隔的发育是有决定性的。此外，Notch通路参与调节神经嵴细胞在心脏流出道区域的正常发育，当Notch通路失活，可导致胚胎严重的先天性心脏发育异常，包括肺动脉狭窄，动脉弓发育异常，提示与血管平滑肌发育缺损有关。而Notch1突变的患者中出现了主动脉狭窄，强调了Notch通路在发育过程中对流出道区域发育的贡献。

4.TGF-β／BMP信号通路

BMP是TGF-β超家族中最大的一族，涉及多种胚胎发育过程。TGF-β／BMP信号通路的下游通路是Smads蛋白家族信号通路，TGF-β／BMP作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制受它们调节的靶基因的转录。BMP4基因突变的小鼠模型中导致了室间隔缺损、心内膜塑形异常及不正常的瓣膜间隔发育，表明BMP4对心脏的发育具有决定性重要作用。BMP信号通路还参与EMT过程和神经嵴细胞的移行。

随着胚胎的发育，心源性中胚层细胞的定向分化是在多条途径的交叉作用下完成的，共同维持心脏的正常发育。有研究表明在胚胎第9天时，Notch信号通路中重组信号蛋白-J的条件性突变可导致心脏发育不全，而通过去除Wnt通路抑制剂Axin2蛋白基因则可使得心脏发育维持正常。由此推测在心脏前体细胞分化和流出道成型过程中Wnt／β-catenin是Notch信号通路的主要下游受体之一。并且在两者均基因突变缺失的试验中，BMP4及BMP相关基因的表达均可恢复，由此又推测出Wnt／β-catenin又是BMP信号通路的上游通路。

心脏胚胎的发育涉及一系列复杂、互相关联的信号途径及转录因子见图1-5。多种信号通路和转录因子在时间空间调控中特异表达，协同维持心脏正常的发育、增生、迁移以及之后分化的平衡。随着时间推移，正确认识心脏正常发育过程中的调控机制对将来预防和干预先天性心脏病的发生及治疗具有重大的指导意义。

（黄瑛　任卫东）