第一节　耐药性进化的基质

一、抗生素作用的复杂性与耐药性表型的多样性

抗生素的作用主要是抑制微生物的生长或杀死微生物，然而通过抗生素亚抑菌作用的研究，表明抗生素在单一细菌水平上作用于微生物，其效果并不局限于单一靶点，而且还有继发效应；如果抗生素在群体水平上作用于微生物，其效果也不局限于只是杀伤致病的或有害的微生物，而且对单个细菌发挥作用的浓度也远低于它们抑制细菌增长或杀灭细菌的浓度。

基因表达的最新研究表明，当细菌暴露在亚抑制浓度的抗生素中，许多细胞的功能（其中一些增加适应度）被改变，如亚抑制浓度的氨基糖苷类抗生素作用于铜绿假单胞菌和大肠埃希菌可诱导其生物膜的形成。铜绿假单胞菌带有氨基糖苷类调节基因（arr），可导致生物膜的形成，对氨基糖苷类抗生素产生特异性耐药。研究表明，抗生素在本质上不仅是战胜细菌的武器，也是调节微生物种群内部平衡的信号传递分子。微生物群落中的竞争意味着竞争者的进攻性仅仅维持在足以控制其菌群大小的水平，以避免单一基因型成为优势，进化成功的标志是生物多样性，而不是某个种群占据优势。进化的主要目的是为了生存，为了保证物种长期持续下去。抗生素既有武器又有信号的生态作用，作为一种武器，耐药性的发生不仅能防止产生抗生素的生物自杀，同时也保护共存的微生物种群的多样性。这一武器在亚致死水平，只是调节同一栖息地中微生物的增长率或改变其基因表达，耐药性的特征就是对这些效果进行修饰和反向调控。耐药性的出现和进化不仅是引起临床上的耐药，也是为保护微生物的相互作用而进行的调控。试想，如果这些相互作用对维持细菌的生活方式非常重要，那耐药性就会在很低的“信号浓度”下产生。总之，抗生素对细菌的影响作用具有多样性，与之相应，耐药性也就从非常特异到非常普通的水平上发生，抗生素耐药性产生的水平见表6-1。

（一）菌群对环境干扰的惰性适应——细菌系统的过剩和简并特性：

尽管抗生素在低浓度下也能对细菌施加一定作用，但对种群内的一些细菌并无影响，种群是可以恢复的。在环境的干扰下生物系统中仍能维持其正常的标准表型，这种对干扰的稳健性或惰性，在一定程度上取决于生物系统的过剩和简并。过剩意味着在系统内有多个相同的单位执行相同或类似的功能，譬如通过高繁殖率维持较高的细胞密度，菌群内个别单位的有害变异对整个种群的负效应就会被稀释。微生物种群中一部分个体受到挑战缺失后，其他几乎相同的个体能够替代它们，并修复整个系统，应该注意的是，依赖较少的个体重建起来的新种群，在一定程度上清除了原始种群的遗传多样性。事实上小的种群由于发生有害变异导致种群灭绝的风险更高。简并意味着结构上不同的单位在系统中可以完成相同的或非常类似的功能。在复杂性更高的水平上，具有简并性的个体可以补偿系统中其他单位的缺失。细菌种群内克隆的多样化很可能被视为一种简并性提高的方式。过剩和简并在高度复杂的细菌系统中，有利于防止抗生素介导的无序化活动，并导致高水平的耐受。

（二）表型耐受

非遗传性抗生素耐药性（非敏感性）说明细菌种群适应抗生素的挑战具有灵活性，从遗传的观点看，完全易感的细菌（缺乏耐药的特异性机制）对抗生素可能表现为表型耐受，即易感菌能在大多数种群死亡的情况下集聚生存，但重生的细菌对原先群体敏感的抗生素保持敏感。虽然稳态的发育，过剩和简并可能有助于这一现象，但是细菌随着细胞周期的生理状态变化可能更起作用。实验表明，当生长的细菌暴露于抗生素的杀菌浓度下，细菌对抗生素的敏感性通常随着时间而下降，但没有发生任何遗传物质的改变。这些对一定浓度的某种抗生素有耐药性的亚群，也能对更高浓度的相同抗生素和其他类型的抗生素产生耐药性。

二、耐药性的基因来源

微生物的耐药基因可能是从抗生素耐药作用以外的机制进化来的，如临床菌株从非临床菌株中获得耐药机制的进化举例见表6-2。从这一点上来看，耐药性应视为机遇的产物，即一种抗生素和一个特定的基因型之间相互作用的结果。另外，一些基因在无抗生素环境下可能是中性的，但具有在适当的抗生素选择环境下表达的潜能，微生物可通过少量的基因突变和基因组合而产生与原始功能无关的新功能。如生物合成细胞壁的酶（如转糖苷酶-转肽基酶），其活性部位的三维结构发生改变可能形成一种β-内酰胺酶，能水解β-内酰胺类抗生素。在其他情况下，只有较小耐药活性的基因扩增也可导致耐药表型。

（一）耐药基因的多元化来源

耐药性决定子的高度多样性，有力地支持它们起源于不同进化谱系的前耐药分子。四环素耐药决定子存在于杆菌、拟杆菌或大肠埃希菌等易感菌株的染色体上；β-内酰胺酶介导的碳青霉素耐药的决定子存在于肠道拟杆菌属或李斯特菌属，染色体介导的β-内酰胺酶通常发现于革兰阴性微生物中；由药物外排泵介导的耐药是一个基因扩展适应的实例，例如链球菌的Mef蛋白质是介导大环内酯类抗生素耐药的蛋白质，几乎所有的微生物（包括奈瑟菌属、拟杆菌属、军团菌属、肠球菌属、乳球菌属、乳杆菌、芽孢杆菌属、地杆菌属或链霉菌属等）都具有该蛋白质的相似序列。氨基糖苷类抗生素钝化酶的基因aac（6′）ib变异，可能会使细菌降低对喹诺酮类的敏感性，这些酶是某些种群染色体基因的正常产物，比如可引起某些肠球菌对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素所谓的“天然耐药”。肠球菌对万古霉素耐药性决定子存在于一些操纵子簇群中，但这些复杂的操纵子簇群是由肠球菌以外的不同菌属来源的基因组成，如类芽孢杆菌属、链霉菌属、拟无枝酸菌或来自肠道菌丛的严格厌氧菌等。可能首先产生由D-Ala：D-Lac连接酶介导的糖肽类抗生素低水平耐药，经过选择和最终的进化而逐渐形成对糖肽类抗生素的耐药机制。另外，目前发现有数十种氨基糖苷类修饰酶和数百种β-内酰胺酶可以灭活氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素。

以上举例说明耐药性的进化是在许多平行的途径上进行的。

在微生物世界里有几乎无限数量和无数种类的潜在耐药决定因子，说明大部分的耐药基因来自于环境细菌。特定区域中所有耐药基因构成了当地的 耐药基因组（resistome），耐药基因组的量是很难查明的。需应用生物信息学数据和宏基因组学的方法去挖掘，以达到描述耐药基因组的目的。例如对金属β-内酰胺酶（MBLs）的分析工作，证明其存在于12种根瘤菌的基因组内，有57个开放读码框架为潜在的MBLs，对4个进行了功能性分析并证明有一个功能性MBL。显然，产生抗生素的微生物可视为高度有效耐药基因的主要来源，可以推测合成抗生素的途径和耐药性两者协同以避免自身损害，也是共同进化的结果。如前所述，这些耐药机制可能起源于它们的看家基因（例如针对氨基糖苷类药物耐药的糖激酶或乙酰转移酶等的表达基因）（表6-1）。

（二）耐药性起源：β-内酰胺酶

β-内酰胺酶的起源和功能问题在本质上仍然是有争议的，从结构和进化的角度来看，PBPs和β-内酰胺酶是彼此相关的。通常假定生产抗生素的细菌为了避免对自我的伤害而合成解毒剂，并且细菌可以协同调节β-内酰胺和β-内酰胺酶的合成过程。土壤的丝状细菌如链霉菌属、诺卡菌属、马杜拉放线菌属产生如β-内酰胺抗生素和β-内酰胺酶，土壤真菌如青霉菌属也能够生产β-内酰胺抗生素。一些参与生物合成的β-内酰胺基因如cef或pcb基因变种，在包括头孢菌属、链霉菌属和青霉菌属等生产抗生素的不同种属中都有相似的序列。经氨基酸序列对比和生物信息学分析得出，所有这些基因是从一个祖先的基因簇进化而来，随后有一些从古老细菌水平转移给致病微生物。大约3.7亿年前，基因在土壤中发生了细菌到细菌、细菌到真菌的水平转移，参与抗生素生物合成的β-内酰胺基因簇，也常常包括β-内酰胺酶和PBPs的基因。有证据显示β-内酰胺酶基因的产物参与了抗生素合成的部分调节，说明β-内酰胺酶和PBPs除具有共同的祖先和基因序列外，也共同参与抗生素生物合成的调控。两者主要是锚固在细菌内膜上，具有涉及合成细胞壁和肽聚糖的功能，PBPs负责组装、维护和调节肽聚糖的结构。同时，大多数β-内酰胺酶在革兰阴性菌能分泌到胞壁周质间隙，在革兰阳性菌可越过胞壁肽聚糖的屏障。在某些革兰阴性菌由于受到PBPs或β-内酰胺类抗生素的作用，其肽聚糖的降解产物可以参与调节β-内酰胺酶的生产，已证明在这些微生物的染色体上的β-内酰胺酶是参与调节肽聚糖的前体。通过对PBPs和β-内酰胺酶的氨基酸序列分析，认为这些蛋白质有一个共同的起源，这两种蛋白质都是活性丝氨酸酶的超家族成员。对PBPs和β-内酰胺酶主要的氨基酸序列比对，揭示两者存在着保守性。此外，大肠埃希菌PBP的定向诱变，和在这些位置上β-内酰胺酶类所对应的氨基酸显示类似的特性，本质上属于相同的结构模式。在PBPs结合青霉素的结构域上可由β-内酰胺酶水解β-内酰胺。

两者的结构也证明在细胞壁上生物合成的β-内酰胺酶来源于PBP。PBPs是古老的蛋白质，大约存在于38亿年前，但是β-内酰胺酶的发现却相对较晚。在这一过程中经数次演变生成了A、C和D类等不同的β-内酰胺酶，为成为有效的抗性酶β-内酰胺酶不得不进行结构改变，以避免与作为PBPs底物的肽聚糖或肽聚糖前体的相互作用。另一种关于β-内酰胺酶起源和功能的假说是：抗生素通常作为次生代谢产物在早期稳定生长期释放。人们推测当细菌处于不利条件下，β-内酰胺酶也可参与催化β-内酰胺从中心水解，回收碳和氮作为能源，作为细菌生长的潜在营养素。包括洋葱伯克霍尔德菌和荧光假单胞菌等生物，在某些环境条件下刺激合成β-内酰胺酶以水解青霉素，可利用青霉素的碳和氮作为唯一的能源。从进化的观点，产生β-内酰胺酶的细菌比不产生β-内酰胺酶的细菌更有优势，尤其是土壤中的种群，前者不仅可以避免被抗生素生产菌分泌的天然β-内酰胺产物的伤害，而且还可以利用β-内酰胺作为营养物质。

三、整体压力调节和抗生素耐药性

因为抗生素只针对敏感菌而消灭了绝大部分的敏感菌，由此却破坏了敏感菌和耐药菌的平衡关系。那些没有被消灭的敏感菌和已经被诱导产生耐药的细菌受到抗生素的刺激后，能获得更强的变异和进化的能力，并逐步从单一的耐药到多重耐药。由此可见，细菌的获得性耐药是一种自然的生物现象，是微生物受到抗生素的选择性压力后所出现的一种自然反应。在大多数情况下，细菌对抗生素的耐药需要在特定的时间才能产生，在抗生素的刺激下需要充分时间被诱导表达耐药机制，才能获得抵御抗生素的能力和被选择出来。抗生素的作用即使在亚抑制条件下也会导致细菌的生理网络的改变，而生理网络和信号放大机制，对细胞的任何干扰立即引发非特异的整体适应机制，其中形成耐药或表型耐受可能就是一种应答的类型。这意味着抗生素以外的因素诱导的非特异性整体应激反应可降低抗生素的作用。抗生素也可能非特异引起SOS适应性反应，例如大肠埃希菌中β-内酰胺介导的PBP-3抑制会通过DpiBA双组分信号转导系统诱导SOS机制。抗生素亚致死量的早期效果可直接导致细菌增殖速率的减少，细菌最终进入对药物的表型耐受并能触发其他的适应性反应。

四、基因突变

（一）突变频率和突变速率

在抗生素耐药的情况下，变异“速率”经常不适当地定义为体外的突变频率，即细菌的种群在体外面对所给定的抗生素浓度检测到突变体出现的计数。这些测试所记录的是突变细胞的数量，而不是突变事件的数量。事实上我们只能选择地记录对细菌有利的突变，即导致细菌存活的耐药表型，因此我们确定的是“突变频率”，而不是“突变速率”。用彷徨试验（fluctuation tests）是可以评价突变速率的。抗生素耐药的情况很复杂，通过表型被选择的突变体中反映的并不是相同的基因型，可以是相似的抗生素耐药表型。如当已知喹诺酮类耐药性的突变速率时，这个速率实际上是几个基因突变速率结合的结果，即编码合成GyrA、GyrB、ParA、ParC的基因、多重耐药系统、钝化作用和靶位保护机制等。在这里计算出的“表型”突变频率是几个不同的“基因型”突变事件的总和。

突变在本质上取决于复制的错误速率，突变是复制时的DNA聚合酶的准确度和各种DNA修复系统相互作用的结果。大多数微生物DNA的碱基对置换突变速率的范围在10-10～10-9细胞/代，这个数字大约低于典型的突变频率（大肠埃希菌是10-8）10倍。较低的突变速率是以维护高准确性DNA聚合酶和修复系统为代价。

（二）超突变

如果环境变化迅速，包括压力条件和瓶颈，突变速率增加并倾向于选择出耐药菌株。超高突变多由基因错配修复系统的损伤造成，尤其是涉及mutS基因、mutL或mutH基因的改变。

肺囊性纤维化患者是被一种或多种系铜绿假单胞菌慢性感染多年后，这些细菌种群适应了囊性纤维化患者高度分区和恶化的肺部环境，以及长期抗生素治疗所导致的免疫系统的变化，这些选择条件增加了突变速率。测定从囊性纤维化患者分离的铜绿假单胞菌的自发突变率，显示36%的患者是被高突变株定植达数年（主要是mutS缺陷型突变体，超过正常的突变频率约10～1000倍），而在铜绿假单胞菌急性感染的非囊性纤维化患者的对照组中没有发现突变菌株。这说明体内的高突变速率与抗生素高耐药率之间是关联的。另有证据显示链球菌、嗜血流感杆菌、葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌等感染致慢性阻塞性肺病，也有超突变株的出现，约有1%的大肠埃希菌株（超高突变株）的突变率是典型突变率（10-8）的100倍，约有11%～38%大肠埃希菌（弱突变株）的突变率超过典型突变率的4～40倍（图6-1）。这些比例明显高于基因随机突变的正常突变率。

从患者和健康志愿者中分离的大型国际系列种群的大肠埃希菌。超高突变株只占菌株的1%，但弱突变株经常会在临床菌株中被发现，在健康志愿者中偶见。

此外，突变频率的增加可能导致肠道菌群适应度的减弱，因为随机的有害性突变比有利的突变更常见。因此通过对高突变性细菌的阳性选择，在菌群中维持了大量的突变率增高菌株。超突变本身不是一个优势，这些菌株可能（靠搭便车）获得一个有利的突变而被选择。不同的大肠埃希菌经常在不同的宿主中循环（特别是在医院），因此这些菌株可能会暴露在各种环境中，经过对高突变性细菌的连续选择过程，菌群中弱突变株的突变频率提高到较高水平，这种结果只出现在那些达到相当规模的菌群，如大肠埃希菌群。事实上，在与非突变株的竞争过程中，当突变株的突变频率达到或高于细菌总数与突变率的乘积时，突变株在种群中就会被固定下来。在规模足够大的种群中，有益的变异往往出现在弱突变株中，因此选择的过程将富集低突变的生物群。弱突变株的自适应可进一步防止强突变株的固定。

变异率显示一定程度的多态性，不同菌株突变率的差异可能反映出所在环境的不同变化。从住院患者血培养中分离的大肠埃希菌株暴露于不同宿主和接触抗生素的时间较长，在产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌（ESBLs）中，超突变性菌株出现的频率较高。

（三）抗生素诱导突变

许多抗生素可刺激细菌的适应性反应，这种反应常通过诱导SOS修复系统来完成，但并不排除其他机制。SOS效应可能是通过作用于DNA和细胞壁的SOS修复系统介导的。诱导SOS修复系统引起突变率提高的抗生素不仅包括损伤DNA的抗生素如氟喹诺酮类，还有β-内酰胺类抗生素。抗生素诱导SOS修复系统，通过SOS效应会促使高错误率的DNA聚合酶PolⅡ、PolⅣ和PolⅤ等的合成，导致转录错误增加，并引起适应性耐药突变。另外，引起翻译错误的抗生素可诱导翻译压力，例如氨基糖苷类抗生素产生了密码的错译，诱导产生非遗传性突变。

五、耐药性的遗传变异特征

（一）基因重组

基因重组可能是对抗基因突变的一种恢复性过程，如一个突变基因导致了对抗生素的耐药，会减少耐药微生物的适应度，微生物在无抗生素时变异的基因可能会被同源的野生基因重组所替代，以恢复适应度和对抗生素的敏感性。这种现象说明一些耐药特征在细菌种群中可以部分渗透。相反，基因重组可能保证与突变相关的耐药表型进行传播。基因重组可以发生在同一菌细胞（基因组内重组），也可在不同菌细胞之间进行，后者需要细菌间的基因水平转移。

细菌细胞壁的障碍或细胞膜渗透性的改变，使抗菌药物不能进入细菌体内到达作用靶位而发挥抑菌作用，是细菌产生的又一自卫性耐药机制。此机制主要见于革兰阴性菌，因其细胞壁脂多糖成分能阻碍许多疏水性抗菌药物进入菌体内而产生耐药性。细菌外膜由于基因突变致结构异常也是细菌产生多重耐药的常见原因。

基因组内重组能促进同源重复基因序列的传播，基因在相同基因组内的同源序列之间转换，能保证非互惠性的传递信息，使细菌获得特定突变的成本（取代突变序列）最小化，或将突变的好处最大化。譬如细菌中其余rRNA不变的情况下，只要有单一的rRNA突变就很容易发生对氨基糖苷类的耐药性，说明有益的突变可以通过基因转换而传播。

细菌之间的基因重组，高度依赖于有效的基因水平转移机制。在人类黏膜表面的微生物中，基因的属内转移能促进与黏膜定植有关的表面蛋白的适应性改变，在优化抗生素耐药性的机制中也应用了同样的策略。在抗生素压力下，一些与β-内酰胺类耐药相关的耐药靶位蛋白嵌合基因也会出现在这些微生物中。大多数细菌中的同源性重组可以发生在序列非常不同的基因之间。

（二）模组化

模组化（modularization）是遗传元件单元经过不同的组合形成新的遗传顺序产生变异性的过程。在细菌群落、细菌、质粒、转座子、整合子的基因组中常见模组化的遗传单位，基因模组是重复保守、松散耦合的基因实体。编码耐药或与耐药高度相关的基因序列（从小到非常大的基因）常常发现于不同种群的细菌中，这些序列的相同性说明微生物在复杂的进化过程中发生了共同进化、趋同进化，更常见的是发生了模组化单位的水平传播。基因模组可经过 模组招募（module-recruiting）模组（如重组酶）的作用、预存模组的复制、基因模组的插入等机制使新的耐药基因加入到基因模组的特定区域，并使基因模组进一步增大。

在特定的多模组结构（整合子、转座子、质粒）内，抗生素耐药特征的累积是一种巢式进化的结果。模组化组件的装配通过转座、同源性重组和不常规的重组等机制完成， 插入序列（insertion sequence，IS）经常参与模组化。例如插入序列（IS26）介导了编码ESBLs的blaSHV基因的转移，载有blaCTX-M基因（常见blaCTX-M-15）的质粒也成功地保证了几个拷贝的IS26的传播，而IS26参与了引起多重耐药的进一步模组化过程。

完美解释捕获有效IS模组的最新例子是ISEcp1B，它从环境生物中的抗坏血酸克吕沃尔菌捕获了野生β-内酰胺酶CTX-M-2基因，并将其插入到大肠埃希菌中，使其对第三代头孢菌素类抗生素耐药。这一功能模组参与许多ESBLs的表达和移动。其他高效IS模组是ISCR-型模组，这种模组不仅捕获和置换ESBLs，而且含有金属-β-内酰胺或联磺甲氧苄啶、氨基糖苷类、氯霉素乃至氟喹诺酮的耐药机制以及大的染色体模组（基因组岛）。ISCR是含公共区域（CR）的IS。原则上多数与适应功能（包括抗生素耐药）相关的模组均可被IS模组募集和移位。参与模组移动的其他元件是DNA转座子和反转录转座子（依靠RNA中间体的移动）。

模组化作用在基因组水平，而突变在基因序列水平，不同模组化的组合主要是随机性的。多数模组化组合无助于甚至降低微生物的适应度，但确有一些组合会对细菌的自适应提供直接的益处，如抗生素耐药性。很可能成功的组合倾向于固化模组之间的连接，使之成为更为复杂的单独的模组起作用。

事实上在不同的宿主中，每一个细菌克隆并不是均匀地分布。在不同的细菌种群或亚种群中，每一个质粒出现的频率并不是相等的。在任何一个物种内的细菌克隆，每一个类型的移动元件的分布也不是均匀的，无论转位子插入质粒的频率，整合子在转位子中出现的频率，还是耐药基因在各种整合子中出现的频率，均具有不平衡性。这些失衡可能是在不同的层级水平上自发产生、不断选择累积的结果。

（三）克隆化

同种的细菌种群经常细分为特定的世系单位：克隆，这可能反映不同的进化历史。多位点序列分型结果表明，一个克隆群中的大多数个体属于有限数量的基因型集群（克隆复合体）中的一个克隆。在大多数情况下克隆频率上升，是表示特殊的环境有利于选择特定的克隆和克隆复合体。每个克隆对应于一个适应度的峰值，即“生态型”，这意味着细菌种群的克隆结构可能反映包括环境梯度在内的各种环境变化，而且克隆中的小变化有利于微进化。我们可以把一种细菌看做由若干克隆和克隆复合体组成的宏观结构，克隆则为一个“区域群落结构”中能提供不同稳定状态的适应性模块。含有耐药基因的可移动因子，如质粒在一个高度同源的多克隆结构中传播可能更为有效，可导致典型的地方性抗生素耐药的复杂局面。

六、基因的水平转移和细菌的变异

基因的水平转移极大地促进了基于基因重组和模组化的进化，特别是细菌细胞和种群之间利用质粒、接合性转座子或噬菌体等传播许多耐药决定子。

（一）质粒和耐药性进化

质粒是细菌染色体以外的DNA，是一种双链、环形或线性，能够自主复制的DNA分子。一种质粒可能编码一种长效杀细菌物质，该物质可被质粒的短效产物解毒，如果该质粒丢失可导致细菌宿主被杀死。该机制在某种程度上已经应用到对抗生素（或重金属）的耐药性上，当该细菌存在一个编码抗生素耐药决定子的质粒，才能在被抗生素污染的环境中生存。耐药质粒通常是细菌后天获得的，可通过性菌毛或噬菌体等媒介在细菌间传播，因为传播途径多样化，这种机制介导的耐药在临床上占重要地位。

质粒使用选择力来维护自身和传播，而且细菌种群中的质粒传播与这些选择力的强度可能成正比。面对抗生素环境选择性的日益增加，质粒立即被整合入抗生素耐药基因。事实上质粒主要家族的多样性是相对有限的，说明抗生素介导的选择使质粒能不断地适应和成功传播老质粒，如最近传播的老质粒就是结合了编码ESBLs的基因序列，在这些质粒的进化中可能继续改变ESBLs基因的序列，在同样的IncN质粒中存在与blaCTX-M-32和blaCTX-M-1基因完全相同的周围基因环境，表明这一类型β-内酰胺酶在细菌内进化。所有的观察表明，细菌种群中质粒的总频率可能增加，这不仅是人为释放越来越广泛的选择剂（如抗菌药物）的结果，而且也与释放其他有机化合物或重金属有关。质粒的绝对增加可能影响着细菌种群的全部进化机制，扩大基因相互作用的数量和多样性。自身可传递的质粒在选择压力下总有可能进入对一种新药耐药的新宿主菌内，新宿主菌可能含有对这种新药耐药的质粒。自然种群的大肠埃希菌的质粒经常显示镶嵌模组化结构，毫无疑问，多种抗生素环境引导着质粒向单一的复制子、甚至相同的基因簇中获得多种抗生素耐药决定子的方向进化。

理论上讲，由于质粒的不相容性和染色体序列不断获取质粒基因（使维持质粒的代价没有必要），在天然的压力和抗生素选择压力下，质粒频率和多样性不断提高的可能性变小。但对大规模的耐药质粒进行分析，结果表明质粒可能通过进化出多复制子质粒或质粒协同整合机制，最终超越不相容性的限制。特定类型的质粒带有特定的耐药决定因子，并存在于特定的细菌谱系，这些细菌的世系获得了宿主进化的优势质粒。质粒在给定宿主中存在，依赖于细胞内的“质粒生态”。该生态包括宿主-质粒相互依赖、限制性修饰系统和其他质粒的存在。质粒能特异而稳定地存在于某些宿主菌中，意味着尽管质粒具有转移到不同宿主的潜能，但这些宿主谱系或克隆能优先接纳特定的质粒，并在产生耐药性方面获得更强的进化性。

（二）转座子和整合子

耐药基因可通过细胞间和DNA分子间的转移和传播而进行水平转移。近期发现，耐药基因通过转座子（Tn）或整合子（Int）在质粒间、质粒与染色体间、乃至同种或不同种属的革兰阴性菌或革兰阳性菌间迁移扩散。

插入序列是染色体特殊的组成部分，可从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至可在不同的染色体之间跳跃。插入序列属于高度可移动性转座因子（transposable element），是对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子DNA片段（＜2.5kb），并常常可以移动邻近的基因。IS因子的大量繁殖及IS因子结合基因插入质粒进行复制，由于它在基因组中的插入可能影响细菌基因的表达和突变。

转座子在耐药基因和耐药性细菌的传播及维护中是重要的。转座子在革兰阴性和阳性细菌中广泛传播，具有一个复杂的结构。金黄色葡萄球菌和其他革兰阳性菌的耐药性基因的转移主要依赖转座子。Ⅰ类转座子因为两侧存在IS序列，可以在不同的DNA序列中自我移动。由不同的转座子完成氨基糖苷类抗生素耐药基因的转移，如链霉素、卡那霉素和博来霉素（Tn5）、氯霉素（Tn9）、四环素（Tn10）。与IS256关联的Tn4001是在革兰阳性菌中传播最成功的一种转座子，该转座子含aac6′- aph2″基因，编码一种能灭活大部分氨基糖苷类抗生素的双功能酶。Ⅱ类转座子广泛分布于革兰阳性和阴性菌，它们具有复杂的结构，使它们能从细菌染色体转移到质粒中，转座子的两端具有一种反向重复序列的基因结构和参与功能活动的序列（转座酶和游离酶），能促进它们在染色体或质粒序列内部进行重组和整合。其中一些Ⅱ类转座子可能含有耐药基因如含blaTEM-1的Tn3或Tn21；另一些Ⅱ类转座子包括在肠杆菌科中含编码四环素耐药基因的Tn916-Tn1545、在肠球菌中编码糖肽类抗生素耐药基因的Tn1456等。此外，一些具有环状结构的接合性转座子能被动转移，例如肺炎链球菌或肠球菌中带有四环素耐药基因（tetM）的转座子。

整合子（integron）是细菌捕获外源性基因并使之转变为自身功能性基因的一种基因表达单位，是通过转座子和接合性质粒在细菌之间进行传播的遗传物质。整合子主要由编码整合酶基因（int1）、基因重组位点、启动子和耐药基因盒组成，即基因盒-整合子系统。由于识别同源序列（整合酶）并促进其表达，整合子能捕获耐药性基因（基因盒）。一般来说，含整合子的细菌比那些缺乏这一结构的细菌更加耐受抗菌药物，整合子可能不只存在一个耐药基因盒，而且整合子可以通过位于质粒中的转座子被转移。大部分的整合子存在于公共卫生重要性较高的微生物中，如鼠伤寒沙门菌、产ESBL的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等。

多种抗生素耐药基因常与被称为“共同区域”（common regions，CRs）的基因相邻，这些CRs聚集为一类特殊的彼此相关的插入序列（IS91），由于IS91和类似的转座因子缺少末端反向重复序列，因此它们转移邻近耐药基因是通过滚环复制的形式进行的。由于Ⅰ类整合子（根据整合酶的类型）整合在转座子和质粒中而被成功地传播，例如与ISCR1结构（或ORF513）有关联的整合子，它们通常与某些ESBL基因（blaCTX-M）、碳青霉烯酶基因和产生喹诺酮类或季铵盐类化合物抗性的qnrA基因等相关。

（三）噬菌体

通过噬菌体介导的抗生素耐药性的转导是耐药性扩散的主要来源。通过细菌DNA测序的信息表明，转导性噬菌体介导的抗生素耐药性的转移或许是驱动细菌进化的主要促进因子，但几十年来人们一直忽视抗生素耐药性与细菌噬菌体的关联性。噬菌体具有插入到细菌基因组的能力，裂解出来时携带着宿主的DNA序列，并可转移到其他细菌，使其成为潜在的抗生素耐药性的传播载体。研究发现噬菌体可在不同环境中将抗生素耐药性有效转移到大肠埃希菌中；在铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、放线菌属等也能传播抗生素的耐药基因；洋葱伯克霍尔德菌能将磺胺甲基异唑（复方新诺明）、甲氧苄啶和红霉素的耐药决定子转导给弗氏志贺菌；多重耐药性基因群（tetG，floR，blaPSE1）从肠道鼠伤寒沙门菌血清型DT104转导至肠道沙门菌的其他血清型，以上都是由噬菌体通过普遍或局限性转导而介导的。已有研究发现从污水样品中分离的噬菌体与来自变形杆菌的各种β-内酰胺酶基因（blaOXA-2，blaPSE-1、blaPSE-4或blaP）相关。

在化脓性链球菌培养液的上清中发现了大量的噬菌体，其中mef（A）基因编码的质子依赖性大环内酯外排系统，而且这些噬菌体可以使大环内酯类易感菌株变成耐药株。高通量序列分析显示，在不同发生系统的化脓性链球菌中，对大环内酯类耐药的菌株携带的mef（A）基因插入到不同的前噬菌体或前噬菌体样元件中，如单独的Tn1207.3，或与tet（O）基因结合的Tn1207.3。炭疽杆菌有非常多样的噬菌体，其中γ噬菌体含有对磷霉素产生耐药性的基因。

七、表型变异和基因型变异

细菌细胞和群体中具有一定程度的可塑性，能够耐受一定浓度的抗生素，不需要产生任何可继承的遗传性改变。微生物可以通过对药物靶点进行“暂时静默”来获得耐药性，这种行为被称为“表型变异”。可能提供细菌这种可塑性的诸因素包括影响DNA超螺旋的调节因素，分解反应的抑制，或生长阶段的特异性调节、翻译、修饰、诱导或应激反应等。这种表型变异机制赋予微生物更大的灵活性，在某些条件下发生的变化是可逆的，表型变异是如此的短暂，以至于很容易忽略了它们的存在。在某种意义上，抗生素诱导产生的耐药性机制还能提供适应性表型变异，如在肠杆菌属或铜绿假单胞菌中与AmpC相关的染色体的β-内酰胺酶。显然，表型变异应该限制抗生素对可遗传变化的选择力量，从而放缓了进化。然而，可塑性在一个适合的环境可能有助于跨越生态适应带，例如在可塑性种群中，抗生素选择作用有利于那些在抵抗抗生素作用中最有效的菌细胞。这个种群细胞中，低效抗生素耐药性突变将比可塑性低表达的细胞更为有效，且可能会被选择出来，超诱导性细胞可能易于演变出固有耐药机制。事实上，即便在没有压力的情况下，压力诱导表型可以被选择性的富集到稳定持续表达的程度。

在抗生素的压力下突变（碱基置换、移码、切除、插入、转座等）是呈数量级的增加。这可能是细菌在极端的抗生素激发的压力下（质膜和细胞壁破坏、蛋白质合成受损、或改变DNA超螺旋）增加突变的速率，并导致该类型的适应性反应。突变速率可以依赖于细菌的生长条件而瞬间增加，像饥饿和引起细菌压力的环境情况（诱导SOS反应），很多抗生素可以诱发SOS级联反应，诸如环丙沙星和其他喹诺酮类等具有抑制DNA拓扑异构酶A亚基的作用，可强有力地诱导SOS反应；另一方面，抗生素也能增强基因在细菌种群之间的传播，如大环内酯类、四环素类和β-内酰胺类抗生素能促进细胞内和细胞间的基因转移。大多数前噬菌体可作为SOS诱导物质而增加前噬菌体的传播，这将显著地影响抗生素耐药基因和毒力因子的传播。抗生素有利于耐药基因和毒性修饰基因的转移，比如氟喹诺酮类药物治疗溶血性尿毒综合征可使该症恶化，这可能与编码志贺毒素的噬菌体扩增有关。总之，环境中的抗生素压力可能同时有助于增加耐药性基因变异，有助于在它们中选择最适应的，并有助于耐药基因的传播，这将加速微生物进化的速率。