第六节　蛋白质的分离与纯化技术

蛋白质是最重要的生物大分子，只有阐明蛋白质的组成、结构与性质才能揭示其生物活性，而要研究一种蛋白质就要获得其高纯度制剂。此外，临床应用的许多蛋白质制剂也是高纯度制剂。本节简要介绍蛋白质的分离、纯化技术。

一、沉淀技术

蛋白质的沉淀作用（precipitation）是指某些因素导致蛋白质从溶液中析出。用透析等物理方法去除使蛋白质析出的因素，如果可使析出的蛋白质再溶解，则这种沉淀作用是可逆的，否则是不可逆的。在导致蛋白质析出的各种因素中，盐析过程是可逆的，酸、碱、重金属盐、尿素、盐酸胍、有机溶剂、生物碱溶剂、表面活性剂及加热等变性因素导致的沉淀过程多是不可逆的。

（一）盐析

在蛋白质溶液中加入少量中性盐可以提高其溶解度，称为盐溶（salting-in）。如果继续加入盐，蛋白质的溶解度反而下降最终从溶液中析出，称为盐析（salting-out）。不同蛋白质盐析所需的盐浓度常常不同，因此，通过改变盐浓度，可以将溶液中不同的蛋白质分别析出。

盐析是蛋白质分离纯化的一个重要步骤，析出的蛋白质仍保持其天然性质，并能再溶解而不变性。在中性盐中，硫酸铵的溶解度最大，受温度的影响较小，是盐析法沉淀蛋白质常用的中性盐。

（二）有机溶剂沉淀

乙醇、丙酮等能与水互溶的中性有机溶剂可破坏蛋白质水化层、降低溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电作用增加而聚集并析出。不过，有机溶剂容易使蛋白质变性，所以实际操作时需优化有机溶剂的浓度，并在低温下进行。

不同蛋白质的氨基酸组成不同、等电点不同，蛋白质在等电状态时分子所带净电荷为零，最容易沉淀，因此上述沉淀过程如果在蛋白质等电点条件下进行效果会更好。

二、电泳技术

蛋白质是一种两性电解质，一定pH值条件下可以解离成带电离子，在电场中向与其所带电荷相反的电极移动，这种现象称为电泳（electrophoresis）。由于不同蛋白质的等电点不同，在同一缓冲溶液中所带电荷及电量均不同，加上各种蛋白质分子量大小不同，在同一电场中的移动速率也就不同，因此，利用电泳技术可以分离提纯蛋白质。电泳技术发展至今已有各种衍生技术，根据支持介质可分为薄膜电泳、凝胶电泳、毛细管电泳等，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳应用最广泛。

（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺与N，N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成，具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙会遇到摩擦阻力，阻力大小与电泳颗粒大小呈正比。因此，电泳颗粒在电泳时受到电场牵引和凝胶摩擦的双重作用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是向蛋白质溶液中加入巯基乙醇和表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）。巯基乙醇能还原二硫键，SDS能破坏非共价键使蛋白质变性，且形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物中SDS所带负电荷量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，因而掩盖了蛋白质本身的电荷差别，使蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率取决于分子量的大小。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，可以将蛋白质多肽链按分子大小分开。

大多数多肽链迁移率与其分子量对数值呈线性关系，若与未知样品同时分析已知分子量的一组蛋白质，并绘制标准曲线，就可通过标准曲线确定未知样品的分子量。

（二）等电聚焦电泳

等电聚焦电泳的特点是在支持介质中加入一种两性电解质，当通以直流电时，两性电解质会在支持介质中形成一个由正极到负极逐步增加的pH梯度。在这种条件下进行电泳时，所有的蛋白质最终都聚焦于与其等电点相当的pH位置上。

（三）双向凝胶电泳

双向凝胶电泳实际上是两种单向凝胶电泳的组合，即在第一向电泳后，再在其垂直方向上进行第二向电泳。如等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向电泳，第一向等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点的不同进行分离，第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳则按分子量不同进行分离，最终把混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

（四）毛细管电泳

毛细管电泳在内径为25～100μm的石英毛细管中进行。与普通凝胶相比，毛细管内径细，易于扩散热量；另外，毛细管电泳电阻大，在较高电压（可高至30kV）下仍可维持较小的电流，可以提高电泳分辨率并缩短分析时间。

三、色谱技术

色谱技术（chromatography）是研究生物分子最重要的技术之一，其基本特征是具有一个固定相和一个流动相，可以根据不同物质在两相中分配系数的不同而分离之。

（一）凝胶色谱

凝胶色谱是指使样品随流动相经过固定相凝胶，样品中各组分按其分子大小不同而分离。凝胶色谱所用的固定相介质通常是一种不带电荷的具有多孔网状结构的颗粒，大分子物质不能进入网孔，不受固定相的阻滞，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙移动，因此流程短，移动速度快，先流出；小分子物质可以进入网孔，阻滞作用大，因此流程长，移动速度慢，后流出（图2-21a）。显然，这种凝胶具有分子筛性质，因而凝胶色谱又称为分子筛。

（二）离子交换色谱

离子交换色谱是指通过在固定相和流动相之间发生可逆的离子交换反应进行蛋白质的分离提纯（图2-21b）。离子交换色谱所用的固定相介质称为离子交换剂，分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类，其化学本质是一种引入了可解离基团的不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖等，其所含解离基团能与溶液中的其他离子进行交换。

（三）亲和色谱

许多生物分子的相互结合是可逆且特异的，例如抗原和抗体、酶和底物、激素和受体等。亲和色谱就是以此为基础建立起来的色谱技术。其基本原理是将上述结合体系中的一方（通常是抗体、底物、激素）连接到固定相介质上，当另一方（相应的抗原、酶、受体）随着流动相流过固定相介质时即可与之特异性结合，通过淋洗除去其他成分，再进行解离洗脱即可获得提纯物（图2-21c）。

四、其他技术

除上述技术之外，离心、透析、超滤等技术也常用于分离提纯蛋白质。

（一）离心

离心（centrifugation）是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转头中，利用转头旋转所产生的离心力将悬浮颗粒按密度或质量的差异进行分离。随着离心技术的不断发展及离心装置的不断革新，离心机的最大转速不断提高，经历了从低速向高速、超速发展的过程。离心机的结构也加入了冷冻系统、真空系统、自控系统，分析用超速离心机还装有光学分析系统，可用于样品的定量分析。电子计算机自动控制程序的引入使得样品分子量、沉降系数及扩散系数等实现了测定自动化，为提高测定速度和测定结果的准确性创造了有利条件。

（二）透析

透析（dialysis）是利用半透膜将小分子与大分子分离的方法。透析时将蛋白质溶液装入透析袋内，然后浸入流动的缓冲液中，小分子就会从透析袋内透出，蛋白质因此得到纯化。透析常用于盐析蛋白质脱盐。

（三）超滤

超滤（ultrafiltration）是应用一种特制滤膜对溶液中不同分子大小的成分进行选择性过滤。当溶液在一定压力下通过滤膜时，溶剂和小分子滤过，大分子被截留。超滤常用于生物大分子尤其是蛋白质的浓缩或脱盐。