第二节 外电场对细胞行为及功能的影响

一、正常细胞的结构与膜电位

细胞是一切生物体结构和功能的基本单位。人体约有10多种不同类型的细胞，其形态和大小随其所在环境和功能不同而呈现显著差异（图1-11）。细胞的基本结构是细胞膜、细胞质和细胞核。细胞膜是由脂类、蛋白质、糖类等组成，脂质分子以非极性基团向内、亲水性基团向外作双分子定向规则排列，膜蛋白镶嵌在脂质双分子层中（图1-12）。细胞膜对离子有一定的通透性，因而具有一定的导电性。但是和以电解质水溶液为主的细胞质的电导相比则小得多。因此，细胞可以近似看作具有介质特性的细胞膜（近似等效于电容）包围着的易导电的细胞质（近似等效于电导）。细胞内含有细胞器及细胞核，前者是指散布于细胞质内具有一定形态和功能的微结构或微器官，包括线粒体、内质网、高尔基体、核糖体及中心体等，后者是指细胞内含有遗传物质DNA的封闭式膜状胞器，由核膜及核仁构成（图1-13）。

人体的主要成分是水和无机盐。水分子是极性分子，氢氧原子间形成极性共价键，相邻的水分子形成不稳定的氢键，使水有较强的内聚力和表面张力。水分子的共价键，其他无机盐分子的正负电荷、有机大分子形成的共价键和电荷区、生物大分子的电荷区等等，组成了生物电的分子基础。分子水平的物质有其特殊的电性。分子的电性是细胞生物电产生的基础。

既然人体各组织和器官的电现象的产生是以细胞水平的生物电现象为基础的，那么，什么是细胞生物电呢？细胞生物电是如何产生的？

（一）细胞静息电位

一个独立的细胞，其细胞表面任意两点间电位相等而无电位差，这是保持细胞正常形态的基本条件。但细胞膜两侧具有电位差。每个细胞内、外都有很多离子，比如Ca2+、Na+、K+等。其中，细胞内K+的浓度是177mmol/L，细胞外液K+的浓度是4mmol/L，浓度差的存在使细胞膜内外电位不同。由于一开始细胞膜内外电荷平衡，而外流的K+带正电，K+的外流使细胞内出现了剩余负电荷，使细胞膜内总体带负电，细胞膜外带正电，两者之间形成了一个电场，电场方向由细胞膜外指向细胞膜内。而K+带正电，它受到顺着电场方向的电场力作用，这种电场力阻止了K+的外流。当这种电场力正好等于浓度差引起的外流力时，K+不再流动，细胞内外达到平衡状态。这种使离子产生运动的电就是人体细胞的生物电，这时的电位差称为细胞的静息电位（图1-14）。

在测量膜电位时，通常将膜外电极接地，使其固定在零电位，安静时记录到的膜内电位一般为负值，范围在-100～-10mV。如骨骼肌细胞约为-90mV，而神经细胞约为-70mV。静息电位是一稳定的直流电位，只要细胞未受刺激并且代谢维持正常，膜内负电位就恒定地持续下去。静息电位（以及其他形式的膜电位）一般用膜外电位为零时的膜内电位的数值来表示。膜电位的绝对值代表电位差的大小，而膜电位的符号说明了膜内电位与膜外电位的关系。例如，静息电位为-90mV有两层含义，一是说明膜内外电位差为90mV；二是说明由于膜内电位是负值，说明膜内电位低于膜外90mV。而膜电位发生变化时，如由-90mV变为-100mV，负值增大（绝对值增大），也称为膜电位增大（电位差增大）；反之，当-90mV变为-70mV时，则称为膜电位减小，而此时膜内电位较静息时升高了。静息电位的产生是由于膜两侧不同极性的电荷积聚的结果，把这种静息时位于膜两侧电荷（外正内负）的分极状态称作极化。当膜电位增大（如-90mV变为-100mV）时，称为超极化；当膜电位减小（如由-90mV变为-70mV）时，称为去极化；细胞在发生去极化后膜电位再向静息电位方向恢复的过程，称为复极化。

（二）细胞动作电位

可兴奋细胞在受到适当刺激后，其膜电位将发生短暂的、可扩布的电位变化，称之为动作电位。细胞的动作电位包括峰电位和后电位两部分，其过程为受刺激后膜电位由静息电位快速地升高，并逆转成为正电位，即膜电位发生了快速和大幅度的去极化变化。随后，膜电位又迅速复极化恢复至静息电位水平，动作电位的去极化和复极化过程进行得非常快，产生的电位变化形似尖耸的峰，称为峰电位。峰电位一般持续时间约1～2ms。

动作电位可沿细胞膜不衰减地传导，直至传遍整个细胞，这是动作电位的一个重要特点。当某一局部受刺激而产生动作电位时，此处细胞膜出现反极化，即表现为外负内正的电位变化，在动作电位发生部位，膜内电位高于邻近的静息部位，而膜外电位则低于邻近的静息部位。由于存在这种电位差，在动作电位发生部位与邻近的静息部位之间便可产生微小的电流。电流方向在膜外由静息部位流向动作电位发生部位，而在膜内则由动作电位发生部位流向静息部位（图1-15），这种电流称为局部电流。局部电流的产生使邻近的静息部位膜内电位升高而膜外电位降低，即发生一定程度的去极化，当去极化达到阈电位水平时，就能触发该处产生新的动作电位。于是，在新产生动作电位的部位又会与其下游相邻的静息部位之间产生局部电流，如此不断向前推进，动作电位便很快传遍整个细胞。

二、脉冲电场中细胞的行为及生物化学变化

以上是细胞本身存在的电现象，那么当一个细胞置身于外加脉冲电场环境下，会发生什么现象呢？

当每厘米数千伏级的电脉冲强度，持续数微秒到数毫秒，就会引起细胞膜半通透性丧失，细胞内带电离子及代谢产物就会无选择地渗漏到细胞外，同时，细胞外的一些药物、分子探针及DNA物质也很容易进入细胞内，我们把这一现象称为电穿孔现象。当更高强度的电场施加于细胞时，细胞膜会发生细胞间的膜融合、膜泡形成甚至细胞膜崩解而致细胞溶解。也就是说，处于脉冲电场中的细胞会发生电穿孔现象、膜融合现象、膜崩解现象等，其中电穿孔现象是最基本的现象。这些现象反映了细胞膜在电脉冲作用下的生物化学变化，对研究细胞膜的结构及功能具有重要意义。

细胞膜在脉冲电场作用下发生电穿孔现象的机制如何呢？我们知道，细胞膜的主要结构是脂质双分子层结构，在此基础上还有一些蛋白质通道。要研究细胞膜的电穿孔机制，首先要弄清楚脂质双分子层发生电穿孔的机制。下面将先阐述脂质双分子层的电穿孔机制，进而阐述细胞膜的电穿孔机制。

（一）脉冲电场引起脂质双分子层电穿孔术的分子机制

在电压150～500mV之间时，脉宽数微秒到数毫秒的电脉冲，就能够使脂质双分子层（lipid bilayer）被击穿。脂质双分子层被击穿时，单位厚度的膜所承受的最大电压称为介电强度，脂质双分子层厚度在5nm时介电强度为300～1 000kV/cm。介电强度主要取决于脉冲电场（pulse electric field，PEF）的电压幅值及时间长短。在PEF作用下，脂质双分子层的脂类分子会发生动力学改变，导致定向分布，从而产生一个亲水极，这样会破坏脂质双分子层对电解质离子的屏障作用，使得脂质双分子层有电流通过，从而产生电热效应（焦耳效应），使得脂质双分子层发生热相变，引起脂质分子构象的改变和重新排列，现有结构膨胀产生新的疏水孔道，然后形成结构上更加稳定的亲水孔道。在这种情况下，脂质双分子层的凝胶相（S态）和液晶相（F态）混合存在，其表观渗透率（apparent permeability），用P_app表示，可以用如下方程式表示：

P_app（T）=P_SαSexp（-E_s/RT）+P_FαFexp（-E_F/RT）+P_BαBexp（-E_B/RT）

式中P为脂质双分子层的渗透性，α为脂质组成成分，E是渗透性的温度依赖术语，相当于Arrhenius活化能，S、F、B分别代表脂质双分子层的凝胶相（S相）、液晶相（F相）和这两相的交界处的脂质聚集相（B相），B相还可以作为测量脂质双分子层波动特性的参数，如交界区域的压缩系数、热容量等。在温度接近脂质小泡的相变温度时，Na+、K+及其他亲水性分子的渗透性存在明显的最大化，处于相变区域的脂质小泡用参数α_B来表示。跨双分子层的各类离子通路在有脂质小泡的交界区域优先形成，用公式表示就是：P_B＞＞P_S、P_F。这些交界区域可以看作是晶格的缺损区，在该区域的脂质分子缺乏相互间的作用力，受到相邻分子的约束力最小，容易发生运动。溶剂分子及水合离子很容易在这些波动的缺损区透过。对于非极性物质，P_F ＞ P_S，P_B=0；对于中性物质，P_F ＞ P_S ＞ P_B。

晶格缺损区不是一成不变的，在数皮秒到数分钟的时间范围内，它一直处于波动状态。脂质分子内的纠缠（如CH₂—CH₂键的顺反式转变）发生在5ns的时间范围内，纠缠构象在其相邻分子间的延伸发生在20～200μs的时间范围内。在这些快速的事件过后，就会出现一个缓慢的、高度相互协作的结构重组，一般在数毫秒到数分钟的时间范围内完成。脂质分子的旋转在数毫秒内完成。脂质的横向弥散系数达1×10-8/（cm2·s），脂质的跨双分子层翻转是一个非常缓慢的过程，一般在数小时到数天的时间范围内完成，可看作是一个时间恒量，在PEF撤出后可测量获得，反映了分子热运动的不同模式。当施加外电场后，电偶的定向速率会加强，加强的程度可根据以下方程式进行计算：

κ_elec=κ₀exp［-rΔΜ_elec·E_membr/RT］

式中κ₀为零电场状态下的速率常数，为κ_elec PEF状态下的速率常数，r是从0～1之间的分摊常数，ΔΜ_elec为分子摩尔电运动的微分，E_membr为跨脂质双分子层的电场强度，R是气体常数，T是热力学温度。脂质双分子层的电穿孔动力学变化可以通过充电脉冲弛豫方法或者电导率方法进行测算。脂质双分子层的电击穿发生在亚微秒时间范围内。一个巨大的脂质小泡（直径40μm）的跨膜电位（ΔΨ_membr）的产生取决于盐浓度，且在微秒时间内完成。理论上讲，ΔΨ_membr的产生和取决于脂质小泡半径（R_cell）的电场强度、介质内部和外部特定的电阻率（r_int和r_ext）之间存在如下函数关系：

ΔΨ_membr=1.5R_cellE_app1 cosθ［1-exp（-t/T_membr）］

式中θ为电场线与常规线（脂质小泡中心到膜表面感兴趣点之间的连线）的夹角，膜的弛豫时间（T_membr）可表示为：

T_membr=R_cellC_membr（r_int+r_ext/2）

式中C_membr为每单位膜面积的电容，由于实验测量得到的T_membr和电穿孔的快相很相似，故膜穿孔可能起始于脂质双分子层存在波动的晶格缺损处。

一旦缺损局部存在电流（i），那么局部就会产热，产热量的大小等于i2rΔt，这里的r是缺损区域的电阻率，Δt是电场的持续时间。局部产热可引起相变或脂质分子的排列紊乱，局部温度可以在数微秒至数毫秒内严重升高，如果Δt的值是数毫秒或更长，那么，局部产生的电流就会产生电渗透作用，从而扩大原缺损区。时间分辨荧光成像方法可以观察到大的脂质小泡（直径40μm）上所形成的微米级孔的大小。脂质双层膜在脉冲电场作用下发生可逆性电穿孔（reversible electroporation，RE）及其随后的修复过程见图1-16、图1-17。

（二）脉冲电场引起细胞膜电穿孔术的分子机制

大家知道，细胞膜和单纯的脂质双分子层不同，细胞膜上面存在许多特定的蛋白质通道，这些蛋白质通道的开放与关闭依赖于跨膜电位，当跨膜电位达到50mV左右时，蛋白质通道开放，达不到时则处于关闭状态。这一跨膜电位远远低于细胞膜的绝缘强度值，因此，不会造成细胞膜的穿孔。如果外加一个脉冲电场，细胞膜上的这些蛋白质通道在跨膜电位（ΔΨ_membr）没有达到击穿（击穿电位为150～500mV）之前会大量开放，这时通过这些通道的电流就会加大，超过原本这些通道能够承受的值，继发的电热效应及通道功能基团的电子构象的改变使这些蛋白质通道发生不可逆性的变性，出现细胞膜穿孔现象。因此，细胞膜的电穿孔，除了具有前述的脂质双分子层的一般机制外，还有细胞膜上这些蛋白质通道的改变机制。细胞膜发生电穿孔的机制及过程见图1-18、图1-19。

细胞膜脂质部分的电穿孔愈合过程类似于脂质双分子层及脂质小泡的电穿孔愈合过程，耗时约数毫秒到数秒；但膜蛋白的情况就较为复杂，这一过程耗时数纳秒到数小时不等。实验研究表明，细胞膜的电穿孔可以通过其渗透性改变、导电性改变及荧光显像等方法进行检测，得出图1-18、图1-19的图示结果。人类红细胞膜上的Na+-K+-ATP酶在外加脉冲电场作用下能够产生跨膜电流，这一效应能够被毒毛旋花子苷所抑制。

对于细胞膜，尚存在电场其他的继发效应，不能通过上述图示所能够展示的。通过快速冷冻电镜法捕捉到的分子事件和导电率测量所得到的结果完全一致。通过导电率测量，一个在亚微秒内形成的孔能够被离子泄露实验记录下来。孔扩大过程发生在100μs内，孔的完全或不完全愈合过程发生在之后的数毫秒内。直到外电场停止后10ms，电镜才能够观察到孔样结构。很明显，电镜捕捉到的相对较大的孔样图像是外电场继发效应造成的，可能反映了细胞支架网络的重组情况。电穿孔后细胞所固有的膜电位的丧失同样会导致脂质的不对称性丧失或胞质内超微结构的丧失。

要想获得大规模的细胞膜结构的改变，就要施加一个能够产生跨膜电位（ΔΨ_membr）为1V的PEF，且脉宽为数毫秒或更长。这时，就会产生很多细胞碎片。倘若PEF的场强稍高于细胞膜击穿电压一点点，就会形成许多细胞膜小泡。显著增高的外电场能够造成被击穿细胞发生继发效应而溶解，这个现象在人类红细胞身上已经得到很好的证明。已经证明，细胞的溶解是由于细胞质中大分子物质造成的胶体渗透压升高造成的。因此，防止细胞出现溶解的方法，也可以采用增加细胞外溶液中的大分子物质的方法来提高细胞外的胶体渗透压，值得一提的是，大分子物质的直径一定要大于细胞穿孔的直径。这样就会阻止细胞肿胀，促进细胞膜愈合（图1-20）。

直到现在，有关PEF对细胞膜的化学方面的效应尚不清楚，ΔΨ_membr将不可避免的改变细胞膜特定蛋白的电荷分布，这种电荷分布的改变通过两种途径实现：一是通过电子构象的改变，另一方面通过氨基酸的磷酸化来改变。PEF也可能会引起一些氧化还原反应，如“-SH”基团及甲硫氨酸的氧化等。电脉冲的副作用也可能会阻碍细胞膜的正常功能，或阻止穿孔的细胞膜修复。

（三）电穿孔现象在生物医学中的应用

电穿孔现象可分为RE和不可逆性电穿孔（irreversible electroporation，IRE），前者主要应用于：①用于基因转染中将外来DNA及质粒导入活体细胞内；②用于细胞融合配制杂合体、杂交瘤及杂种胚胎等；③用于在细胞膜内插入蛋白质；④用于癌细胞化疗中提高化疗药的运送及效能；⑤用于将人类细胞和动物组织融合而制作动物模型；⑥用于激活细胞膜载体及酶；⑦用于改变活体细胞的基因表达。后者主要用于肿瘤的消融，只针对肿瘤细胞的细胞膜，使其凋亡，细胞外骨架结构能够保持完整，特别适合于靠近血管、其他管道结构、空腔脏器周围的肿瘤消融，能够选择性地灭活肿瘤，而保持其他结构的完整，这是本书以后章节重点讲述的内容。先于肿瘤消融的IRE技术应用于食品工业的杀菌消毒，这里不再赘述。